謝 彤 巨韓芳 趙德福 穆 成 趙 慧 吳振萍 王擷秀

天津地區(qū)結(jié)核分枝桿菌可變串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性研究*

謝 彤 巨韓芳 趙德福△穆 成 趙 慧 吳振萍 王擷秀

目的：分析天津地區(qū)流行結(jié)核分枝桿菌（MTB）基因組中分布的可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）拷貝數(shù)目多態(tài)性，探討不同MTB菌株分辨能力強(qiáng)的VNTR基因分型方法。方法：根據(jù)VNTR位點PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度分析臨床分離的102株MTB菌基因組中22個VNTR位點中重復(fù)序列拷貝數(shù)目，使用Hunter-Gaston分辨指數(shù)（H）評估各個VNTR位點的多態(tài)性和VNTR基因分型方法對菌株的綜合辨別能力。結(jié)果：13個VNTR位點對不同MTB菌株具有較強(qiáng)的分辨能力，其分辨指數(shù)達(dá)0.996 3。其中QUB11b、11a、18、26，MIRU-26、31和Mtub21的多態(tài)性較好（H值為0.442~0.699）；MIRU-10、27、39、40，QUB1895 和 ETR-A 位點的多態(tài)性尚可（H 值為 0.203~0.316）；而 MIRU-2、4、16、20、23、24，QUB1451，ETR-B 和 C 的多態(tài)性差（H 值為 0.000~0.150），其中 MIRU-2、20、24 和 QUB1451 在北京家族菌株中沒有多態(tài)性（H=0）。結(jié)論：選擇多態(tài)性好的位點組合可以有效地區(qū)分不同的MTB北京家族菌株，建立起菌株分辨能力強(qiáng)的VNTR分型方法。

分枝桿菌,結(jié)核 串聯(lián)重復(fù)序列 基因型 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳 流行病學(xué),分子 天津

結(jié)核病分子流行病學(xué)研究通過基因分型技術(shù)準(zhǔn)確地分辨不同的菌株，追蹤結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB） 的傳播途徑，從而在結(jié)核病暴發(fā)流行時甄別結(jié)核傳播鏈上的患者、追蹤傳染源、評估防控措施效果及確認(rèn)實驗室交叉污染等方面發(fā)揮重要作用?？勺償?shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat，VNTR）分型是基于PCR技術(shù)建立起來的MTB菌株分型方法，VNTR以分布在基因組中VNTR位點所含重復(fù)串聯(lián)序列拷貝數(shù)目不同來區(qū)分不同的MTB菌株。本研究通過評估天津地區(qū)分離MTB菌株中22個VNTR位點多態(tài)性，探討臨床菌株分辨能力強(qiáng)的VNTR基因分型方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2005年10月—2006年9月天津市結(jié)核病控制中心102株臨床MTB菌株。菌株分離自102例患者，其中初治患者81例，復(fù)治患者21例，男67例，女35例，年齡15~83歲，中位年齡36歲。83例患者在患病期間居住在天津市區(qū)，19例患者來自武清、東麗、寧河、北辰、薊縣及西青等6個區(qū)縣。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自申能博彩生物科技有限公司，Q-溶液購自德國QIAGEN公司，實驗中引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。Taq酶為寶生物Probest和天根生物2×Taq MasterMix。VNTR分型結(jié)果應(yīng)用PAUP 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取 從L-J培養(yǎng)基中挑取一菌環(huán)MTB溶于500 μL PBS中，細(xì)菌經(jīng)80℃，60 min滅活，使用CTAB法細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，操作步驟在BSL-2級生物實驗室中按說明書進(jìn)行。提取得基因組DNA溶于50 μL滅菌去離子水中。

1.2.2 MTB北京家族株鑒定 MTB北京家族株鑒定采用Warren等[1]報道的方法。即PCR方法擴(kuò)增該家族基因組中所特有的IS6110插入序列與Rv2820之間的序列，引物為Bj_F 5′-TTCAACCATCGCCGCCTCTAC-3′,Bj_R 5′-CACCCTCTA CTCTGCGCTTTG-3′；非北京家族則擴(kuò)增北京家族MTB基因組缺失片段Rv2819，引物為n-Bj_F 5′-GATCGCTTGTTCTC AGTGCAG-3′，n-Bj_R 5′-CGAAGGAGTACCACGTGGAG-3′。PCR反應(yīng)采用 25 μL體系，2×Taq MasterMix（天根生物）12.5 μL，引物的終濃度為 0.4 μmol/L，模板 DNA 為 10~100 ng。擴(kuò)增條件均為 95℃5 min變性后，94℃ 30 s；58℃40 s；72℃30 s，30個循環(huán)，最后經(jīng)72℃10 min。若MTB為北京家族，則PCR擴(kuò)增片段長度為393 bp，而非北京家族PCR擴(kuò)增片段長度為570 bp。

1.2.3 VNTR PCR分析 對研究中所有菌株22個VNTR位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列參照文獻(xiàn)[2]報道。經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化，PCR 反應(yīng)在含有 200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L 引物，1.5 mmol/L MgCl2，1.5 U Taq酶和10~100 ng基因組 DNA的25 μL體系中進(jìn)行。經(jīng)95℃5 min變性后，熱循環(huán)溫度條件為95℃45 s；52~60℃1 min；72℃1 min，共 30個循環(huán)。為增強(qiáng)PCR反應(yīng)效率，MIRU-26，QUB18、1451位點PCR反應(yīng)體系中加入5 μL的Q-溶液。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%~2.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用Quantity One凝膠分析軟件測定產(chǎn)物的分子質(zhì)量，并與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比較，以確定臨床分離菌株中每個VNTR位點中重復(fù)序列的數(shù)目。

1.2.4 VNTR位點多態(tài)性分析 實驗中每個VNTR位點的多態(tài)性評估和VNTR位點組合對菌株的鑒別能力采用Hunter－Gaston 指數(shù)（Hunter－Gaston discriminatory index，H）進(jìn)行評價，其計算公式為算，N為實驗菌株總數(shù)，S為VNTR分型中實驗菌株不同基因型的數(shù)目，nj為第j個基因型的菌株數(shù)。

1.2.5 VNTR基因分型結(jié)果分析 VNTR分型結(jié)果采用PAUP軟件分析，將實驗中所獲得的VNTR分型結(jié)果字母化后，編輯Nexus格式程序文件，采用除權(quán)配對法（unweighted pair-group method of arithmetic averages，UPGMA） 繪制系統(tǒng)樹，基因分型完全相同的MTB菌株稱為基因分型成簇株，從不同的患者中分離的菌株基因分型成簇則提示這些肺結(jié)核患者之間可能存在著相互傳播。

2 結(jié)果

2.1 MTB北京家族株流行 使用PCR分別擴(kuò)增北京家族和非北京家族基因組差異序列，在所分析的102株菌中，93株（91.2%）為北京家族株。

2.2 VNTR位點的基因多態(tài)性 應(yīng)用針對VNTR位點兩側(cè)序列的引物分別擴(kuò)增22個VNTR位點，表1顯示了研究中所使用的22個VNTR位點在所分析的102株MTB菌株中的多態(tài)性。QUB11b、18、11a的多態(tài)性較好，H值分別為 0.699、0.630和0.574。在MIRU位點中，MIRU-26的H值為0.543，在所分析的菌株中該位點的串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)目為2~11，見圖1。選擇在多態(tài)性較好的13個VNTR 位 點 ， 包 括 QUB11b、18、11a、26、1895，MIRU-10、26、27、31、39、40，Mtub21 和 ETR-A，作為天津地區(qū)流行菌株的VNTR基因分型位點組合H值達(dá)到0.996 3，而目前在VNTR分型中經(jīng)常使用的12個MIRU位點對天津地區(qū)分離菌株分辨指數(shù)僅為0.870 4。

表1 結(jié)核分枝桿菌基因組VNTR位點多態(tài)性

2.3 VNTR分型聚類分析 VNTR分型結(jié)果系統(tǒng)樹圖，見圖2。使用本研究中所選擇的13個VNTR位點對臨床分離的102株MTB進(jìn)行基因分型研究。102株MTB被分為3個基因群。第1、2個基因群中分別含有4株和5株MTB，其余的93株北京家族組成第3個基因群。所有菌株被分為88個基因型，其中78個基因型為菌株獨特型（基因型僅包含1株MTB菌），其余10個基因型中每個基因型包含2~4株基因分型相同的MTB菌株，形成基因分型簇株。

3 討論

VNTR位點廣泛存在于人類及細(xì)菌的基因組中，幾乎所有的VNTR位點都位于非編碼區(qū)，是以同一種短序列重復(fù)串聯(lián)為特征，其序列重復(fù)的次數(shù)具有高度的個體特異性。VNTR基因分型就是利用菌株間基因組內(nèi)VNTR位點的拷貝數(shù)目不同而分辨不同的菌株。早期的MTB基因分型研究中，不同的研究部門使用不同的VNTR位點組合，一般僅使用5個被稱之為ETR的VNTR位點組合對MTB進(jìn)行基因分型研究。隨后的其他研究中利用MTB基因組中其他的VNTR位點，包括QUB位點組合、Mtub位點組合，開展對MTB的基因分型研究。Mazars等[3]采用的12個MIRU位點組合使用最為廣泛。但隨著研究的不斷深入，Scott等[4]發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）基因分型相比，12個VNTR位點對MTB株的鑒別能力不強(qiáng)，特異性低。若以此對MTB分型會引起成簇菌株的分類錯誤，過高估計MTB的近期傳播，因此12個MIRU位點不適宜用于以人群為對象的大規(guī)模結(jié)核病分子流行病學(xué)研究。

天津地區(qū)流行菌株中北京家族占91.2%，與柴利泉等[5]的報道相近。本研究中12個MIRU位點對天津地區(qū)流行菌株分辨指數(shù)僅為0.870 4，而其他一些地區(qū)研究中MIRU位點對北京家族有較好的分辨率（H=0.975）[6]，提示在天津地區(qū)流行的MTB菌株，特別是北京家族株的多樣性較低，這一家族在天津的傳播可能主要由近期傳播所導(dǎo)致。Kam等[7]研究提示某些QUB位點在MTB中的多態(tài)性較高，在北京家族株中11a和11b位點H值分別為0.514和0.669，這與本研究中（0.531和0.675）的結(jié)果相近。此外，Kam等發(fā)現(xiàn)Qub3232位點的多態(tài)性非常高，但在一些菌株中此位點無法擴(kuò)增，Supply等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)此位點難于擴(kuò)增。

本研究中QUB26位點的H指數(shù)為0.566，高于Kam等[7]人報道，與Smittipat等[2]的研究相近。此外Smittipat等[2]對VNTR位點多態(tài)性的評估研究中提示Mtub21對于北京家族的H指數(shù)高達(dá)0.694，國內(nèi)最新研究報道為0.570[9]，本研究中該位點在北京家族菌株中的H指數(shù)為0.397，與Mokrousov等[10]最新報道（H=0.330）相近。筆者認(rèn)為對北京家族菌株中同一個位點在不同研究中分型指數(shù)出現(xiàn)差異主要是由于當(dāng)?shù)亓餍芯甑牟町愒斐傻?，因為即使是北京家族株，其在人群傳播過程中會形成多個進(jìn)化分支。最新研究證實在不同的北京家族流行地區(qū)其主要流行株的亞型并不相同[11]。綜上，筆者認(rèn)為一個地區(qū)開展以人群為基礎(chǔ)的大規(guī)模VNTR分型研究時，有必要對該地區(qū)部分流行菌株的VNTR位點的多態(tài)性進(jìn)行綜合評價，以確定VNTR位點組合，提高VNTR分型對不同MTB菌株的分辨能力，在MTB北京家族高流行區(qū)某些QUB位點可以顯著提高VNTR基因分型對不同菌株的分辨能力。

[1] Warren RM,Victor TC，Streicher EM.et al.Patients with active tuberculosis often have different strains in the same sputum specimen[J].Am J Respir Crit Care Med，2004,169(5):610-614.

[2] Smittipat N,Billamas P,Palittapongarnpim M,et al.Polymorphism of variable-number tandem repeats at multiple loci in Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2005,43(10):5034-5043.

[3] Mazars E,Lesjean S,Banuls AL,et al.High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology[J].Proc Natl A-cad Sci USA,2001,98(4):1901-1906.

[4] Scott AN,Menzies D,Tannenbaum TN,et al.Sensitivities and specificities of spoligotyping and mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing methods for studying molecular epidemiology of tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2005,43(1):89-94.

[5] 柴利泉,李衛(wèi)民,李麗,等.天津地區(qū)臨床分離結(jié)核分枝桿菌分型的初步研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2007,28(8):785-788.

[6] Sun YJ,Bellamy R，Lee AS,et al.Use of mycobacterial interspersed repetitive unit variable number tandem repeat typing to examine genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis in Singapore[J].J Clin Microbiol,2004,42(5):1986-1993.

[7] Kam KM,Yip CW,Tse LW,et al.Optimization of variable number tandem repeat typing set for differentiating Mycobacterium tuberculosis strains in the Beijing family [J].FEMS Microbiol Lett,2006,256(2):258-265.

[8] Supply P,Allix C,Lesjean S,et al.Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit–variablenumber tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2006,44(12):4498-4510.

[9] 李墨，焦偉偉，孫桂芝，等.不同VNTR位點組合用于北京基因型結(jié)核分枝桿菌基因分型的研究 [J].中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(6):505-509.

[10]Mokrousov I,Narvskaya O,Vyazovaya A,et al.Mycobacteria tuberculosis Beijing genotype in Russia:in search of informative variable-number tandem-repeat loci[J].J Clin Microbiol,2008,46(11):3576-3584.

[11]Wada T,Iwamoto T,Maeda S,et al.Genetic diversity of the Mycobacterium tuberculosis Beijing family in East Asia reveled through refined population structure analysis[J].FEMS Microbiol Lett,2009,291(1):35-43.

Polymorphism of Variable-Number Tandem Repeat in Mycobacterium Tuberculosis Strains Isolated from Tianjin

XIE Tong,JU Hanfang,ZHAO Defu,MU Cheng,ZHAO Hui,WU Zhenping,WANG Xiexiu

Tianjin Centers for Disease Control and Prevention,Tianjin 300011,China

Objective:To investigate the polymorphisms of variable-number tandem repeat(VNTR)in Mycobacterium tuberculosis（MTB）,and develop high discriminatory power of VNTR typing.Methods:The copy numbers of 22 known VNTR loci(12 MIRU,3 ETR，6 QUB and Mtub21)were analyzed among 102 MTB strains isolated from Tianjin according to the size of PCR fragments.Polymorphisms of each VNTR locus and discriminatory power of optimized VNTR loci set were assessed using Hunter-Gaston index respectively.Results:The 13 VNTR loci set(MIRU-10,26，27,31,39，40,QUB11b，11a，18，26,1895,ETR-A and Mtub21)optimized in this study had the high discriminatory power with H=0.996 3.QUB11b，11a，18，26，MIRU-26，31 and Mtub21 showed the high polymorphism(H:0.442-0.699).The discriminary power of MIRU-10,27,39,40,QUB1895 and ETR-A were moderate(H:0.203-0.316).Other loci including MIRU-2,4,16,20,23,24,QUB-1451,ETR-B and C were poorly polymorphism （H:0.000-0.150）,of which 4 loci(MIRU-2，20，24 and QUB-1451)had no polymorphism at all in Beijing genotype.Conclusion:The optimized 13-VNTR loci set were highly discriminative for Beijing family.The number and combination of informative VNTR loci for epidemiological study need to be determined according to the locally prevalent strains.

Mycobacterium tuberculosis tandem repeat sequences genotype polymorphism，genetics epidemiology,molecular Tianjin

*天津市科委應(yīng)用基礎(chǔ)研究資助項目（項目編號：07JCYBJC08800）

300011 天津市疾病預(yù)防控制中心

△通訊作者 E-mail:drzdf@163.com

（2010－05－23收稿 2010－07－10修回）

（本文編輯 李鵬）