熊 毅 趙 璟 趙 鑫

（1.重慶市設(shè)計(jì)院，重慶 400015）

（2.中國石油天然氣管道工程有限公司天津分公司，天津 300280）

（3.大港油田灘海開發(fā)公司，天津 300280）

1 引 言

作為一門現(xiàn)代生物學(xué)，分子生物學(xué)（Molecular Biology）是在生物化學(xué)與遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物物理學(xué)等學(xué)科相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的嶄新學(xué)科.它將研究對(duì)象主要集中于細(xì)胞大分子—蛋白質(zhì)與核酸，通過研究生物大分子之間相互關(guān)系和作用，從分子水平上對(duì)生物體的多種生命現(xiàn)象進(jìn)行研究.分子生物學(xué)技術(shù)不僅節(jié)省了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的時(shí)間，避免了經(jīng)典微生物技術(shù)在多樣性研究中的局限性以及由此引起的種群丟失、種群結(jié)構(gòu)不清等弊病，提高了檢測的靈敏度，也可以更可靠、更直接地反映微生物多樣性在生態(tài)系中原始構(gòu)成情況，而且它們的運(yùn)用能對(duì)環(huán)境樣品中的微生物進(jìn)行原位觀察，充分反映樣品中原有的微生物組成情況，能有效、快速地得到環(huán)境樣品的微生物信息.隨著時(shí)間的推移，分子生物學(xué)技術(shù)越來越成熟，特異性越來越強(qiáng)，如今已能檢測特定微生物群落的動(dòng)態(tài)變化和活性.

廢水生物處理技術(shù)研究中分子生物學(xué)檢測技術(shù)的應(yīng)用始于1990年代中期，主要采用的檢測技術(shù)包括熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescent In Situ Hybridazation，F(xiàn)ISH）、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、DNA測序及序列分析等.文章針對(duì)目前在廢水生物處理微生物檢測中通常采用的 PCR-DGGE檢測技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)及其在廢水處理新工藝中的應(yīng)用進(jìn)行述評(píng)，以期對(duì)該技術(shù)在廢水生物處理中的實(shí)用價(jià)值有全面深入的了解.

2 PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 PCR-DGGE方法的優(yōu)點(diǎn)

PCR-DGGE的結(jié)合是目前進(jìn)行微生物鑒定、原位觀測中最為有效也是廣泛采用的方法，主要優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：[1]

1）不需要培養(yǎng)直接從所研究的樣品中抽提總DNA，然后對(duì)16S rRNA的可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過變性梯度凝膠電泳（DGGE）進(jìn)行分析，能檢測到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，發(fā)現(xiàn)一些原來沒有檢測到的新的微生物種類.PCR-DGGE基本工作流程見圖1.

圖1 PCR-DGGE基本工作流程

2）檢測極限低

Muyzer[2]等用這種方法能檢測出數(shù)量僅占總?cè)郝鋽?shù)1%的微生物.Omar等[3]證實(shí)PCR-DGGE技術(shù)檢測極限大約為1%～3%，如果結(jié)合使用rRNA雜交技術(shù),還可使檢測極限降至0.1%左右.

3）檢測速度快、經(jīng)濟(jì)

Omar等[4]利用該法實(shí)時(shí)實(shí)地地研究了墨西哥玉米面團(tuán)Pozol在發(fā)酵過程中不同階段微生物種類和數(shù)量發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化.PCR-DGGE方法能在取樣后8小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測樣品狀態(tài)，因此可以根據(jù)實(shí)際需要迅速作出調(diào)整.

4）結(jié)果準(zhǔn)確可靠

傳統(tǒng)的生化鑒定方法雖然也能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，但會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，主觀性比較強(qiáng)，而且會(huì)漏掉一些不能培養(yǎng)的微生物.而PCR-DGGE方法則能客觀完整地鑒定微生物，結(jié)果也很直觀，它根據(jù)參考菌株和樣品微生物16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中的相對(duì)位置來進(jìn)行判斷.若將凝膠上的條帶切割下來測序，然后與基因庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，就可以得出它們的遺傳相關(guān)性.[3]

5）同時(shí)檢測多種微生物

DGGE凝膠上至少可以區(qū)分10個(gè)清晰可辯的條帶，每個(gè)條帶可能來自不同的微生物.

6）與其它方法結(jié)合

DGGE可以和許多方法結(jié)合，從而全面認(rèn)識(shí)微生態(tài)的組成、優(yōu)勢菌群等.實(shí)際上，這種結(jié)合起來的方法目前被認(rèn)為是研究環(huán)境微生物真正的系統(tǒng)發(fā)育的最有力的手段.近些年來，,這一觀點(diǎn)得到了強(qiáng)調(diào)和重視.PCR-DGGE可以和傳統(tǒng)方法、糖和發(fā)酵產(chǎn)物分析、雜交技術(shù)、測序技術(shù)等結(jié)合起來，且都能得到較好的結(jié)果.

2.2 PCR-DGGE技術(shù)的局限性

任何方法都有一定的偏差，分子技術(shù)雖然可以避免傳統(tǒng)方法的不足但也有其自身的缺陷.[4,5,6]

首先，它在制樣和樣品處理的過程中可能產(chǎn)生一定偏差.清洗、混勻、冷凍或離心等步驟嚴(yán)重影響了微生物的生存，造成菌種的改變或菌數(shù)的變化.DNA的抽提更會(huì)導(dǎo)致對(duì)樣品中微生物的選擇，而且菌數(shù)的不同也會(huì)影響DNA的提取濃度和檢測限.另外環(huán)境微生物生長的基質(zhì)（脂類、蛋白質(zhì)、碳水化合物、鹽類等）越復(fù)雜，抽提就越困難，去雜就越不容易，而這些殘存的雜質(zhì)很可能會(huì)成為抑制劑影響PCR的擴(kuò)增.因此首先要對(duì)DNA的提取進(jìn)行優(yōu)化，提高抽提率及DNA產(chǎn)物的純度.

PCR技術(shù)本身也存在不足，1992年Reysenbach發(fā)現(xiàn)用rDNA基因在PCR過程中會(huì)產(chǎn)生優(yōu)先擴(kuò)增現(xiàn)象，只擴(kuò)增部分細(xì)菌的DNA，造成了群落中原始成員的減少.另一個(gè)問題就是嵌合體的形成或異源雙鏈的產(chǎn)生.它會(huì)影響 DGGE圖譜中條帶的分布.DGGE只能分離較小的片段(1 kb以下)，較長的片段分離率下降，這就限制了系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量.

其次，若選用的條件不是特別適宜，DGGE并不能保證可以將有一定序列差異的DNA片段完全分開，可能會(huì)出現(xiàn)不同序列DNA的共遷移現(xiàn)象.再者，有些細(xì)菌具有多操縱子，使同一種菌的DGGE圖譜上出現(xiàn)多條帶，從而高估了樣品中微生物的多樣性.

DGGE另一個(gè)突出問題是關(guān)于分辨率和檢測限的問題.通常該法只能檢測到優(yōu)勢菌的存在.Muyzer的研究表明，只有占整個(gè)群落細(xì)菌數(shù)量約 1%或以上的類群能被檢測到.事實(shí)上，檢測限和樣品中微生物濃度也有很大關(guān)系，該法的檢測范圍一般為104～108 cfu/ml.檢測限度也取決于具體的菌種或菌株.一般微生物群落中其他成員的濃度和數(shù)量也會(huì)影響目標(biāo)菌的檢測限，因?yàn)樗鼈兛捎绊慏NA的抽提率，并在PCR擴(kuò)增時(shí)競爭模板.

表1 DGGE技術(shù)的主要優(yōu)缺點(diǎn)

3 PCR-DGGE在廢水生物處理新技術(shù)中的應(yīng)用

廢水生物處理新技術(shù)主要是指近年來不斷開發(fā)出來的新型脫氮除磷技術(shù).尤其是在生物脫氮過程中，近年來出現(xiàn)了一些超出人們傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)的新現(xiàn)象，這些現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為水處理工作者設(shè)計(jì)處理工藝提供了新的理論和思路，開創(chuàng)了一些生物脫氮的新途徑和方法，并由此開發(fā)出一些新型的脫氮工藝，它們逐漸成為各國學(xué)者研究的焦點(diǎn).目前世界上正進(jìn)行研究的這類工藝主要包括 SHARON、ANAMMOX、CANON以及OLAND等.本節(jié)圍繞PCR-DGGE技術(shù)在新型脫氮工藝中的研究應(yīng)用，對(duì)PCR-DGGE技術(shù)在廢水生物處理新技術(shù)中的應(yīng)用作一綜述.

3.1 SHARON工藝

SHARON（ Single Reactor High Activity Ammonium Removal Over Nitrite）工藝由荷蘭Delft技術(shù)大學(xué)Hellinga等人于1997年開發(fā)成功.該工藝包括兩個(gè)步驟，即首先控制水中的氨氮轉(zhuǎn)化過程，使硝化過程僅僅進(jìn)行到亞硝化階段，接著進(jìn)行反硝化，水中的亞硝酸鹽氮在缺氧條件下由反硝化菌轉(zhuǎn)化為氮?dú)舛摮?由于無須生成硝酸鹽氮，因而可以節(jié)省能量的消耗和電子供給體.

SHARON工藝的技術(shù)關(guān)鍵在于如何將氨氧化控制在亞硝酸鹽階段，其本質(zhì)就是如何使亞硝化菌相對(duì)于硝化菌成為優(yōu)勢菌種.采用常規(guī)微生物手段的研究焦點(diǎn)主要集中在如何培養(yǎng)、分離亞硝化菌上，很多學(xué)者在這方面進(jìn)行了大量研究，比如找到了適合亞硝化菌生長的培養(yǎng)基、掌握了一些亞硝化菌的生理特性等.[7]但是這些研究通常耗時(shí)很長，效率較低，有時(shí)僅亞硝化菌的富集就需要60d.[8]而且由于肉眼在辨別篩選菌落的過程中無法精確判斷，這使得有些功能菌很可能被人為忽略掉.而分子生物學(xué)無需對(duì)工藝中微生物進(jìn)行純培養(yǎng)，可以在一次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可能存在的所有菌種并且得到精確判斷，避免了常規(guī)培養(yǎng)中的人為誤差，節(jié)省人力物力.首次對(duì)SHARON工藝中的微生物組成情況應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究的是 Susanne等人.[9]他們認(rèn)為，既然SHARON工藝在反應(yīng)過程及工況控制上與傳統(tǒng)脫氮工藝大有區(qū)別，其反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落也有可能與傳統(tǒng)工藝不同.基于這一認(rèn)識(shí)，他們首先采用PCR-DGGE 16S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器內(nèi)至少存在四種不同微生物，通過與 16S rRNA基因庫內(nèi)數(shù)據(jù)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其中有一種占主導(dǎo)地位（69%）的細(xì)菌與Nitrosomonas europaea有98.8%的相似性.

3.2 ANAMMOX工藝

1990年荷蘭Delft技術(shù)大學(xué)的Kluyver生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化現(xiàn)象（Anaerobic Ammonium Oxidation，ANAMMOX)，即在厭氧條件下，微生物以NO2-為電子受體，NH4+為電子供體，將NH4+、NO2-轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨(dú)?與傳統(tǒng)硝化—反硝化生物脫氮途徑相比，這一過程節(jié)省大量能耗，因而將成為廢水脫氮領(lǐng)域中一種經(jīng)濟(jì)有效的處理手段.

在厭氧氨氧化基礎(chǔ)理論研究方面，對(duì)具厭氧氨氧化功能的細(xì)菌分類研究一直是重點(diǎn)之一.雖然ANAMMOX菌廣泛存在，在土壤干濕界面、海底缺氧環(huán)境、海灣都有厭氧氨氧化現(xiàn)象發(fā)生，但由于ANAMMOX菌生長緩慢，對(duì)氧敏感，且只有在高濃度時(shí)才顯示出活性，使得傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法至今還沒有獲得ANAMMOX菌純培養(yǎng)物[10].而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為鑒定環(huán)境中的細(xì)菌提供了有力的工具，在厭氧氨氧化細(xì)菌的分類研究中起了至關(guān)重要的作用.

Strous等[11]最先采用PCR-DGGE技術(shù)測定了一種厭氧氨氧化細(xì)菌的16S rDNA序列，最終確定出他們發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌在細(xì)菌進(jìn)化樹上的位置，研究表明該種細(xì)菌屬于浮霉?fàn)罹?Planctomycetales)，并命名為 Candidatus Brocadia anammoxidans.為鑒定菌群中的厭氧氨氧化菌，B.anammoxidans的16S rDNA基因序列被用來設(shè)計(jì)為特定的寡核苷酸探針，以用于熒光原位雜交（FISH）.Schmid等[12]基于PCR-DGGE方法在德國幾個(gè)污水處理廠發(fā)現(xiàn)了一種新的 16S rDNA序列，這些序列形成一個(gè)明顯獨(dú)立的種群，其中有85 %的細(xì)菌與已發(fā)現(xiàn)的B.anammoxidans的16S rDNA序列相似性少于90%.因此，這種新的厭氧氨氧化菌 被 命 名 為 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis.Egli[13]在瑞士Kolliken附近處理有毒廢物垃圾填埋場的生物轉(zhuǎn)盤中富集到一種厭氧氨氧化菌，用 16S rDNA鑒定，16S rDNA序列與B.anammoxidans有 90.9%相 似 ， 而 與 K stuttgartiensis有 98.5%～98.9%相似，可認(rèn)為是 K. stuttgartiensis細(xì)菌.

迄今為止，用 PCR-DGGE無需純培養(yǎng)，已經(jīng)鑒定出5個(gè)ANAMMOX 菌種，它們是Candidatus“Brocadia anammoxidans”、Candidatus “Kuenenia stuttgartiensis”、Candidatus “Scalindua brodae”、Candidatus “Scalindua wagneri”、Candidatus“Scalindua Sorokinii”，均屬于浮霉?fàn)罹?由于至今未能成功分離得到純菌株，因此尚未獲得正式命名和分類.但目前又有研究表明，自然環(huán)境中還存在一種以前未被發(fā)現(xiàn)的可進(jìn)行厭氧氨氧化的細(xì)菌.雒懷慶、胡勇有采用分子生物學(xué)方法從已培養(yǎng)的具有厭氧氨氧化活性的污泥中提取細(xì)菌總DNA，經(jīng)純化、特異引物PCR擴(kuò)增、克隆、測序等過程，進(jìn)化分析結(jié)果顯示培養(yǎng)獲得的細(xì)菌與已發(fā)現(xiàn)的Candidatus Brocadia anammoxidans、Anaerobic ammonium-oxidizing Planctomycete、 Uncultured anoxic sludge bacterium KU1 細(xì)菌在進(jìn)化上關(guān)系較近，但比對(duì)分析結(jié)明所研究的細(xì)菌與上述細(xì)菌的DNA序列相似度不高.

3.3 CANON/OLAND工藝

CANON（Completely Autotrophic Nitrogen Removal Over Nitrite）工藝首先由荷蘭Delft大學(xué)提出，其微生物學(xué)原理為：亞硝化菌在有氧條件下把氨氧化成亞硝酸鹽，厭氧氨氧化菌則在無氧條件下把氨和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氮?dú)?，即利用亞硝化菌和厭氧氨氧化菌的協(xié)同作用，在同一個(gè)反應(yīng)器中完成亞硝化和厭氧氨氧化.OLAND（限氧自養(yǎng)硝化—反硝化，oxygen limited autotrophic nitrification and denitrification）工藝是1998年由比利時(shí)根特大學(xué)微生物生態(tài)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)研制的，是部分硝化與厭氧氨氧化相耦聯(lián)的生物脫氮反應(yīng)系統(tǒng).該工藝通過限氧調(diào)控（溶解氧0.1～0.3 mg/L）實(shí)現(xiàn)了硝化階段亞硝酸鹽的穩(wěn)定積累，并實(shí)現(xiàn)了生物脫氮在較低溫度（22～30℃）下的穩(wěn)定運(yùn)行.雖然OLAND強(qiáng)調(diào)的是控制溶解氧，但是，從OLAND和CANON的反應(yīng)條件和反應(yīng)情況來看，二者可能是同一機(jī)理，只是由不同的人發(fā)現(xiàn)而冠以不同的名字而已，還需要人們進(jìn)一步的試驗(yàn)和考證.

荷蘭Delft大學(xué)Sliekers等[14]應(yīng)用分子生物技術(shù)發(fā)現(xiàn)CANON工藝中可能存在三種微生物：類亞硝化單胞菌的好氧氨氧化菌、類浮霉?fàn)罹膮捬醢毖趸约把趸瘉喯跛猁}的硝化菌和硝化螺菌，并分析了它們在系統(tǒng)中的相互反應(yīng)與競爭關(guān)系.Egli等[15]人則分析了生物膜CANON工藝的生物構(gòu)成和基質(zhì)代謝的途徑.董遠(yuǎn)湘[16]等人用 PCR-DGGE技術(shù)對(duì)OLAND中硝化階段不同時(shí)期的生物膜中微生物的種群動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析.研究表明，群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群的數(shù)量具有時(shí)序動(dòng)態(tài)性，微生物多樣性與廢水的處理效果出現(xiàn)協(xié)同變化的特征.測序結(jié)果表明，在生物膜中進(jìn)行氨氧化作用的主要為亞硝化桿菌（Nitrosomonas sp.）、亞硝化螺菌（Nitrosospira sp.）；進(jìn)行亞硝酸氧化的主要為硝化球菌（Nitrococcus sp.）.張丹等人[17]考察了生物脫氮系統(tǒng)中硝化菌群（氨氧化菌和亞硝酸氧化菌）種群多樣性及硝化菌群隨溶解氧降低的種群變化規(guī)律，采用DGGE分子檢測技術(shù)對(duì)硝化菌群的16S rDNA的特異性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了分析,結(jié)果表明：OLAND生物脫氮系統(tǒng)中氨氧化菌和亞硝酸氧化菌隨溶解氧的降低表現(xiàn)出了不同的種群變化規(guī)律，氨氧化菌種群多樣性受溶解氧的影響非常大，而亞硝酸氧化菌的種群多樣性比較單一,且不受溶解氧的影響.在OLAND限氧穩(wěn)定運(yùn)行后期，亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）是主要的氨氧化菌,占OLAND限氧亞硝化階段反應(yīng)器中總細(xì)菌數(shù)的72.5%左右.

4 未來的展望

以PCR-DGGE為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展為廢水生物處理新工藝中的微生態(tài)與微生物特性提供了強(qiáng)有力的方法和手段.通過檢測廢水生物處理中微生物種群DNA序列多態(tài)性、鑒定個(gè)體基因，就可以在基因水平上評(píng)價(jià)種群的遺傳分化，并在分子水平上闡述分子適應(yīng)等生態(tài)問題的機(jī)制，這對(duì)更好地揭示廢水生物處理新技術(shù)中微生物與環(huán)境之間的生態(tài)學(xué)關(guān)系以及為實(shí)現(xiàn)新型脫氮工藝系統(tǒng)的優(yōu)化運(yùn)行具有深刻的理論研究意義與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

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