烏云格日勒，胡揚，衣龍彥，聶晶，王景玲，吉洪書

●成果報告Original Articles

從HEPC基因篩選預(yù)測HiHiLo訓(xùn)練對左心室結(jié)構(gòu)與功能影響的分子標(biāo)記

烏云格日勒1，2，胡揚2，衣龍彥2，聶晶3，王景玲4，吉洪書5

通過對HEPC基因SNP/A2032G與HiHiLo訓(xùn)練后左心室結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)分析，從HEPC基因中篩選預(yù)測HiHiLo訓(xùn)練效果的分子標(biāo)記。方法：對66名平原地區(qū)居住的北方漢族男子進行為期30天的HiHiLo訓(xùn)練，測定其訓(xùn)練前后安靜狀態(tài)和遞增負(fù)荷運動下的左心室結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)。應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)解析受試者SNP/A2032G多態(tài)性，采用關(guān)聯(lián)方法分析SNP/A2032G與訓(xùn)練前后左心室結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：（1）HiHiLo訓(xùn)練后，受試者ESD、EDD、PWD、IVSD、LVM和LVMI等6項心室結(jié)構(gòu)指標(biāo)均增長；心室功能指標(biāo)中HR、CO、COI下降，而SV、SVI和EF增長。（2）HiHiLo訓(xùn)練后，AA型PWD和IVSD的增加量顯著高于AG型和GG型，AA型100W/HR的下降量顯著高于GG型，AA型Re/SV和Re/SVI的增加量顯著高于AG型和GG型。結(jié)論：HEPC基因SNP/A2032G的AA型可以作為預(yù)測HiHiLo訓(xùn)練后心室結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)訓(xùn)練效果的分子標(biāo)記。

HEPC基因多態(tài)性；HiHiLo訓(xùn)練；左心室結(jié)構(gòu)；左心室功能

HiHiLo作為一種有效的耐力訓(xùn)練方法，通過缺氧和運動兩方面的刺激提高運動員的運動能力[1]。但是運動員在高原缺氧的適應(yīng)能力上存在很大的個體差異，這種個體差異決定了高原訓(xùn)練效果的好壞[2]。同時，低氧訓(xùn)練效果的個體差異與基因多態(tài)性有關(guān)[3]。鐵是人體適應(yīng)耐力訓(xùn)練、提高運動能力的必要條件之一。長期的運動訓(xùn)練不僅增加機體鐵的丟失量，同時也減少腸道對鐵的吸收，使機體鐵貯備下降[4]，從而直接影響運動員Hb合成、氧的運輸和儲存能力及ATP合成。在機體鐵代謝過程中，hepcidin是調(diào)節(jié)鐵吸收和釋放的中心調(diào)控因子[5]。它不僅在小腸和肝臟中表達(dá)，而且也在心肌細(xì)胞中表達(dá)[6]，其作用通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的鐵代謝進而影響人體運動能力。因此，可以推測HEPC是影響運動能力的重要候選基因，但有關(guān)HEPC基因多態(tài)性與運動能力關(guān)系的研究尚未見報道。本研究通過探討中國北方漢族男性HEPC基因SNP/A2032G與30天HiHiLo訓(xùn)練后左心室結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性，為制定個體化HiHiLo訓(xùn)練方案提供分子標(biāo)記。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

中國北方漢族平原地區(qū)健康男性在校大學(xué)生66人，試驗前無低氧居住史，平均年齡（20．73±1．48）歲，身高（177．95±5．10）cm，體重（68．66±7．52）kg。受試者均知情同意。

1.2 試驗方法

1.2.1 低氧訓(xùn)練方案高?。菏茉囌呙刻煸谘鯕鉂舛葹?4．8%～14．3%（模擬海拔高度約為2 800～3 000m）的低氧房中休息和睡眠10 h（晚21：00至次日晨7：00）；高練：每周進行3次低氧訓(xùn)練，即在濃度為15．4%～14．8%（海拔約2 500 m～2 800 m）的常壓低氧環(huán)境中，以個體75%VO2max強度蹬踏功率自行車（Monark818型功率自行車、瑞典），將受試者的SpO2維持在87%～93%，HiHiLo訓(xùn)練期限為30天。

1.2.2 基因多態(tài)性分析Hepcidin基因位于19q1311，全長約2．5 kb，SNP/A2032G多態(tài)是Hepcidin基因標(biāo)簽SNP位點，位于第1內(nèi)含子，雜合度近40%。采用Promaga公司試劑盒提取全血DNA，primer premier5．0自行設(shè)計引物，上游引物為5'-GGCAACACAACCAGACCCCAC-3'；下游引物為5'-GCCTCCTCCTCTTTCCACAGC-3'。

15μL反應(yīng)體系：DNA模板（0．4μL），Taq酶（0．2μL，5U/μL），dNTP（0．4μL，10mM），Mg2+（1．2μL，25mM），上下游引物各2μL（0．05μg/μL），PCR buffer（2μL），其余7．2μL用滅菌雙蒸水補齊。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 m in；變性95℃30 s，退火62．5℃30 s，延伸72℃30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物340 bp。限制性內(nèi)切酶分析：內(nèi)切酶MspI在37℃水浴3 h消化擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳，用DL2000DNA marker作為長度標(biāo)記判斷酶切后DNA片斷的長度，并用凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像分型。

1.2.3 左心室結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)的測定（1）測試方法：受試者靜坐10min。測定安靜時的左心室結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)。準(zhǔn)備活動：按60 r/min節(jié)律零負(fù)荷下踏車2m in以適應(yīng)踏車節(jié)律。運動方式：臥式蹬車的極限下遞增定量負(fù)荷運動。受試者以50W起始負(fù)荷、60 r/m in的頻率蹬車，每3 min增加50W負(fù)荷，直至150W負(fù)荷蹬踏3 min后結(jié)束，總負(fù)荷時間9min。平臥恢復(fù)3 min。分別測定50W、100W、150 W負(fù)荷和恢復(fù)期的心室結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)。在HiHiLo前后各測定1次。

（2）測試儀器：Doppler超聲心動圖儀（CarisPLUS-DU3，Eastoe，Italy），Polar表（POLARa3，Polar Electro OY，F(xiàn)inland），臥式功率自行車（Ergotest ER3/A，Erich Jaeger，Germany）。

（3）測試指標(biāo)：心室結(jié)構(gòu)指標(biāo)為左室收縮末期內(nèi)徑（ESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（EDD）、左室舒張末期后壁厚度（PWD）、舒張末期室間隔厚度（IVSD）、左室心肌質(zhì)量（LVM）、左室心肌質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。心室功能指標(biāo)為心率（HR）、每博輸出量（SV）、每博輸出量指數(shù)（SVI）、心輸出量（CO）、心指數(shù)（COI）、射血分?jǐn)?shù)（EF）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用χ2檢驗確定受試者人群的基因型頻率是否符合H-W遺傳平衡定律。所有數(shù)據(jù)在K-S檢驗的基礎(chǔ)上，計算出訓(xùn)練前和訓(xùn)練后變化量（△=訓(xùn)練后-訓(xùn)練前）。用變化量（△）表示訓(xùn)練敏感性，即訓(xùn)練效果。原始數(shù)據(jù)進行了正態(tài)檢驗，對不滿足方差檢驗的數(shù)據(jù)，均轉(zhuǎn)換成對數(shù)進行了檢驗，使總體服從正態(tài)分布。并采用Box's檢驗與Levene’s檢驗，驗證了能否滿足重復(fù)測量方差分析的前提條件?；蛐徒M間和組內(nèi)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析和一元方差分析。數(shù)據(jù)處理采用SPSS13．0軟件。差異檢驗顯著水平為P＜0．05。

2 結(jié)果

2.1 HEPC基因SNP/A2032G基因型及等位基因的分布特征

HEPC基因SNP/A2032G擴增片斷長度為340 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI內(nèi)切酶消化后，出現(xiàn)3種類型條帶：有MspI酶切位點的純合型為236 bp和57 bp兩條帶，沒有MspI酶切位點的純和型為293 bp一條帶，雜和型為293 bp、236 bp和57 bp3條帶（見圖2）。受試者基因型分布頻率為AA型7人（11%）；AG型人19（29%）；GG型40人（60%）。經(jīng)卡方檢驗，其結(jié)果為：χ2（df=2）= 1．753，P=0．440，表明研究對象符合H-W平衡定律，具有群體代表性。

圖1 Hepc基因SNP/A2032G多態(tài)PCR-RFLP電泳結(jié)果（1.2.3.5.6為GG型，4.7.8.9.11.12為AG型，10.13.14AA型，Marker為DL2000 DNA Marke r）Figure 1 Electrophoretic patterns ofHepcidin gene observed by PCR-REFP analysis（Lane1.2.3.5.6 are homozygous GG，Lane10. 13.14 is homozygous AA，Lane 4.7.8.9.11.12 are heterozygous AG. Marker is DL2000 DNA Ma rker）

2.2 HEPC基因SNP/A2032G與耐力訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)性

2.2.1 與心室結(jié)構(gòu)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性不同基因型的心室結(jié)構(gòu)各指標(biāo)的初始值沒有顯著差異；經(jīng)30天HiHiLo訓(xùn)練后，不同基因型的PWD和IVSD的變化量有顯著差異，AA型PWD和IVSD的增加量顯著高于AG型和GG型（P＜0．05）（見表1）。

表1 SNP/A2032G多態(tài)性各基因型心室結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化Table 1 Change of the leftventricular structure for SNP/A2032G polymorphism

2.2.2 SNP/A2032G與心室功能指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性（1）與心率的關(guān)聯(lián)性。在安靜狀態(tài)下，不同基因型HR初始值有顯著差異，GG型顯著高于AA型（P＜0．05）；訓(xùn)練后AA型的100W/HR下降量顯著高于GG型（P＜0．05）（見表2）。

表2 SNP/A2032G多態(tài)性各基因型R的變化Table 2 change ofHR forgenotype o f SNP/A2032G polymorphism

（2）與每搏量的關(guān)聯(lián)性。3種基因型的SV和SVI的初始值沒有顯著差異；訓(xùn)練后，不同基因型的Re/SV和Re/SVI的變化量有顯著差異，AA型Re/SV和Re/SVI的增加量顯著高于AG型和GG型（P＜0．05）（見表3）。

表3 SNP/A2032G多態(tài)性各基因型每博量的變化Table 3 change o f SV and SVIfor geno type of SNP/A2032G polymo rphism

（3）與心輸出量的關(guān)聯(lián)性。不同基因型的CO和COI的初始值有顯著差異，GG型的CO和COI的初始值顯著高于AA型（P＜0．05）；但訓(xùn)練后的變化量沒有差異（見表4）。

（4）與射血分?jǐn)?shù)的關(guān)聯(lián)性。不同基因型的EF的初始值之間有顯著差異，AG和GG型EF初始值顯著高于AA型（P＜0．05）；但訓(xùn)練后的變化量沒有差異（見表5）。

表4 SNP/A2032G多態(tài)性各基因型的心輸出量與心指數(shù)的變化Tab le 4 change o f CO and COIfor genotype of SNP/A2032G po lym orphism

3 討論

經(jīng)H-W平衡檢驗，三種基因型的分布頻率符合H-W平衡定律。本研究受試者均來自北京體育大學(xué)運動系和體育系在校大學(xué)生，因其基因型分布頻率符合H-W平衡定律，因此確定具有群體代表性。而且H-W平衡是根據(jù)2項分布原理檢驗的，當(dāng)樣本量足夠大時趨于近似正態(tài)分布，可以滿足方差檢驗的前提。盡管有兩個組的樣本量小于10，但由于通過了球型檢驗與列文檢驗，故能滿足本文統(tǒng)計處理的前提要求。

表5 SNP/A2032G多態(tài)性各基因型射血分?jǐn)?shù)的變化Table 5 change of EF forgenotype o f SNP/A2032G polymorphism

3.1 HiHiLo訓(xùn)練后左心室結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)變化的分析

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過30天HiHiLo訓(xùn)練后，受試者的ESD、EDD、PWD、IVSD、LVM和LVMI等6項心室結(jié)構(gòu)指標(biāo)均有所增長，其平均增長率依次為0.95‰、0.36‰、2.44%、1.64%、3.73%和4.14%。其中，做為判斷心臟肥大的重要指標(biāo)PWD、IVSD、LVM和LVMI的增長率具有統(tǒng)計學(xué)意義。通常，訓(xùn)練引起的心臟肥大能夠增加心肌的收縮力量，而ESD和EDD的增加可使心室容積擴大，有利于左心室泵血功能的改善。Svedenhag等[7]曾對優(yōu)秀運動員進行30天高原訓(xùn)練后，發(fā)現(xiàn)運動員左室舒張末期內(nèi)徑、舒張末期室間隔厚度和左室舒張末期后壁厚度有所增加，而且，心肌質(zhì)量也顯著增加。該報道與本研究結(jié)果基本一致。

經(jīng)過30天HiHiLo訓(xùn)練后，受試者安靜時、遞增負(fù)荷下（50 W/100W/150W）和恢復(fù)時期的SV/SVI顯著增加，而HR和CO/COI顯著下降；安靜時的EF和50W/EF顯著增加，雖然100 W/EF、150W/EF和Re/EF有所增加，但沒有顯著差異。HR的明顯下降，表明左心舒張時間延長，心臟的儲備能力增強；每搏量和射血分?jǐn)?shù)的增加，表明心肌收縮能力增強，左室充盈量增加，心臟泵血功能提高。而CO/COI的下降，一方面是因為HR的下降，另一方面可能是由于低氧暴露后RBC和Hb含量的增加[8～9]，提高了血液的氧氣運輸能力。

訓(xùn)練后不少指標(biāo)變化量（△）的最小值為負(fù)值，如HR，敏感性高則下降值大，負(fù)值也大。計算標(biāo)準(zhǔn)差時由于負(fù)值平方變成正值，這樣計算得到的標(biāo)準(zhǔn)差極易出現(xiàn)大于均值的現(xiàn)象。當(dāng)然樣本量小也是重要因素，所以有必要再加大樣本量進一步驗證。

3.2 HEPC基因多態(tài)性與左心室功能指標(biāo)訓(xùn)練效果的關(guān)聯(lián)分析

本研究結(jié)果表明，（1）rs7251432與PWD、IVSD的訓(xùn)練敏感性關(guān)聯(lián)。經(jīng)過30天的HiHiLo訓(xùn)練后，AA型PWD和IVSD的增加量顯著高于AG型，反映AA型左心室壁增厚顯著，心臟結(jié)構(gòu)有所改善。（2）rs7251432與HR、CO、COI和EF的初始值和100W /HR、Re/SV和Re/SVI的訓(xùn)練敏感性關(guān)聯(lián)。訓(xùn)練前安靜時GG型的HR、CO、COI高于AA型，AG和GG型的EF顯著高于AA型，在3種基因型中AA型的心功能初始水平最低。但是，經(jīng)過HiHiLo訓(xùn)練后，不同基因型之間100W/HR、Re/SV和Re/SVI的變化量出現(xiàn)顯著差異，AA型100W/HR的下降量顯著高于GG型，而Re/SV和Re/SVI的增加量顯著高于AG型和GG型。表明AA型SV增加HR下降，心臟的儲備能力增強，在完成同等負(fù)荷的條件下心臟機能出現(xiàn)節(jié)省化，這種功能的變化與上述結(jié)構(gòu)變化是一致的。

本研究分析了HEPC基因SNP/A2032G多態(tài)性與6項心室結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。HIF（HIF-1和HIF-2）是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10]，在維持機體鐵平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。hepcidin是機體鐵代謝的中心調(diào)控因子[5]，與HIF之間的聯(lián)系已被研究證實[11]。低氧時Hif-1通過改變hepcidin、DMT1、DcytB的表達(dá)來緩解鐵缺乏的狀態(tài)。而且，HIF-1可誘導(dǎo)EPO基因的表達(dá)增加[12]，而EPO抑制肝臟hepcidin mRNA的表達(dá)[13]。另外，HiHiLo訓(xùn)練可使運動員發(fā)生功能性鐵缺乏[14]，鐵缺乏可以使hepcidin mRNA的表達(dá)量也減少[15]，從而增加小腸的鐵吸收量和巨噬細(xì)胞鐵的釋放量來滿足低氧時的需鐵量。Merle等人[16]通過大鼠在體實驗證實了hepcidin mRNA和蛋白質(zhì)在心臟的表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)低氧時，肝臟hepcidin表達(dá)減少，相反，心臟hepcidinmRNA的表達(dá)和蛋白水平卻顯著上調(diào)。另外，運動可使大鼠肝臟hepcidinmRNA的表達(dá)顯著下降[6.17]，有利于十二指腸鐵吸收。Roetto等[18]和Porto等人發(fā)現(xiàn)[19]，葡萄牙家庭兩名成員HEPC基因位于基因5，非翻譯區(qū)mRNA加帽位點單核苷酸變異，表現(xiàn)為心力衰竭，嚴(yán)重影響了心臟的正常功能。說明，低氧時可能通過Hif-1通路，影響hepcidin mRN A在心臟的表達(dá)，而HEPC基因變異與心臟結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)，直接影響心臟的功能。本研究結(jié)果表明，HEPC基因SNP/ A2032G的AA型與HiHiLo訓(xùn)練后的心室結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的變化關(guān)聯(lián)。

4 小結(jié)

對66名健康男子30天的HiHiLo訓(xùn)練結(jié)果表明，Hepcidin基因SNP/A2032G多態(tài)性與HiHiLo訓(xùn)練效果明顯關(guān)聯(lián)。訓(xùn)練后，AA型PWD和IVSD的增加量顯著高于AG型和GG型；AA型100W/HR的下降量顯著高于GG型，AA型Re/SV和Re/SVI的增加量顯著高于AG型和GG型，總趨勢表現(xiàn)為AA＞GG和AG。這一結(jié)果與AA型左心室結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的變化相一致。本研究結(jié)果提示，HEPC基因SNP/A2032G的AA型可作為預(yù)測HiHiLo訓(xùn)練后心室功能指標(biāo)訓(xùn)練效果的分子標(biāo)記。

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Genetic Marker for Predicting the Effectof HiHiLo Training on Left Ventricular Structure and Function from HEPCGeneSelection

WUYUN Gerile1.2,HU Yang2,YILongyan2,NIE Jing3,WANG Jingling4,JIHongshu5
（1.School of PE,Inner Mongolia Normal University,Hhhot 010022,China;2.Graduate Schools,Beijing Sports University,Beijing 100084, China;3.School of PE,Jiangxi Normal University,Nanchang 330027,China;4.Qingdao Sport Training Center,Qingdao 266023,China;5. Nanjing Institute of Physical Education,Nanjing 210014,China）

Objective:The association between SNP/A2032G in HEPC gene and the change of left ventricular structure and function after HiHiLowas analyzed and to provide as a genetic marker that can predict the efficiency of HiHiLo training.Methods:66male college-students from North of China were completed HiHiLo training for 30days and left ventricular structure/functional parameters in static and incremental exercise status for pre-post training was measured respectively.The SNPwas differentiated by PCR-RFLP,then association between the change of left ventricular structure/function parameters and SNP/A2032G was analyzed by association studies with training response phenotypes.Results:(1)The ESD,EDD,PWD,IVSD,LVM and LVMI of subject were increased,and HR,CO and COIwere decreased,but SV,SVIand EF were increased.(2)The increase of PWD and IVSD with AA were significantly higher than that AG and GG genotype,and an amountof decrease of 100W/HRwith AA genotypewas severity than GG genotype.Moreover,the increase of Re/SV and Re/SVIwith AA genotype was significantly higher than AG and GG genotype.Conclusion:AA genotype of SNP/A2032G wasmaybe used as a geneticmarker that can predict the efficiency with left ventricular structure/function after HiHiLo training.

HEPC gene polymorphism;HIHILo training;left ventricular structure;left ventricular function

G 804.7

A

1005-0000（2010）04-0282-05

2010-04-14；

2010-05-31；錄用日期：2010-06-05

科技部奧運攻關(guān)項目（項目編號：2006BAK12B01）

烏云格日勒（1963-），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，內(nèi)蒙古師范大學(xué)副教授，北京體育大學(xué)博士研究生。

1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)體育學(xué)院，呼和浩特010022；2.北京體育大學(xué)科學(xué)研究中心，北京100084；3.江西師范大學(xué)，南昌330027；4.青島體育訓(xùn)練基地，青島266023；5.南京體育學(xué)院，南京210014。