[摘要]目的:研究轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在體外對人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPDLFs)分泌基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)的影響，進而探討TGF-β1對HPDLFs分泌MMP-1的調控作用，以期為通過生物學途徑建立防治正畸過程中牙根吸收的有效方法提供理論依據。方法:原代培養(yǎng)HPDLFs，取傳代至第5代HPDLFs實驗。設立TGF-β1工作濃度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml;0ng/ml TGF-β1為空白對照組;選取4h、8h、12h、24h、48h 5個時間點收獲上清液。雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗 (enzyme-linked-immunosorbent serologic assay，ELISA)法檢測各樣本中MMP-1含量。采用多元線性回歸方法分析實驗結果。結果:MMP-1分泌量與TGF-β1作用時間總體上存在時間依賴性，具有統(tǒng)計學差異，P<0.05。但各作用時間下MMP-1分泌量與TGF-β1工作濃度并沒有表現出一致的劑量依賴關系;4h時各實驗組MMP-1分泌量隨TGF-β1濃度的遞增而下降; 8h、12h、24h時，各實驗組MMP-1分泌量與TGF-β1工作濃度基本呈正相關;48h時各組MMP-1含量變化較大沒有明顯趨勢。結論:MMP-1分泌量與TGF-β1作用時間存在顯著時間依賴性，TGF-β1可通過促進MMP-1分泌參與正畸過程中牙根吸收的發(fā)生和發(fā)展。

[關鍵詞]牙根吸收;轉化生長因子β1;基質金屬蛋白酶-1;牙周膜成纖維細胞

[中圖分類號]R783 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)02-0245-05

The preliminary study of TGF-β1 effect onhuman periodontal ligament fibroblasts secreting MMP-1

LIU Qi1，CAO Jun1，LI Zhi-dong2，XIE Han3，LIU Xin-wei1，XU Jing4，LI Xin-ping5

(1. Department of Orthodontics， School of Stomatology of Fourth Military Medical University， Xi’an 710032，Shaanxi，China;2. Department of Microorganism of Fourth Military Medical University;3. Department of Periodontics， School of Stomatology of Tongji University;4. stomatological hospital of Xi’an Second Hospital;5. Department of Stomatology affiliated to Naval Command College)

Abstract:Objective To investigate the biological effects of transforming growth factor-β1(TGF-β1) on human periodontal ligament fibroblasts(HPDLFs) secreting matrix metalloproteinase-1(MMP-1). Methods HPDLFs were exposed to TGF-β1 at various concentrations(0.03ng/ml，0.05ng/ml，0.07ng/ml and 0.09ng/ml) in monolayer cultures.The levels of MMP-1 secreted by the TGF-β1-treated HPDLFs were measured using an enzyme-linked immunosorbent assay.Differences between experimental and contol groups were tested using multiple linear regression analysis.ResultsOur data demonstrate TGF-β1 treatment significantly increased the secretion of MMP-1 in a time-dependent manner(P<0.05). However，differently concentrated TGF-β1 effect HPDLFs secreting MMP-1 differently at each moment. ConclusionThe secretion of MMP-1 is regulated by TGF-β1. TGF-β1 play an important role in root resorption during orthodontic tooth movement.

Key words:root resorption;TGF-β1;MMP-1;HPDLFs

牙根吸收是正畸治療過程中的常見并發(fā)癥。有學者認為幾乎所有的正畸患者都存在某種程度的牙根吸收[1-2]。雖然大部分牙根吸收沒有明顯的臨床癥狀，但嚴重者則可能危害牙齒與牙周組織健康，因此正畸醫(yī)師必須對根吸收有足夠的認識。大部分關于牙根吸收與正畸治療關系的研究表明， 基質金屬蛋白酶在牙周組織改建過程中起著至關重要的作用，其中屬于膠原酶類的MMP-1參與了細胞外I、II、III、VII，X 型膠原纖維的降解，其表達分泌與牙周組織改建、牙根吸收的發(fā)生密切相關。本研究旨在通過檢測TGF-β1對人牙周膜成纖維細胞分泌MMP-1的調控，進而篩選出與正畸過程中牙根吸收發(fā)生發(fā)展相關的生物因子，以備進一步建立牙根吸收的防治策略。

1材料和方法

1.1 實驗材料:①細胞培養(yǎng)用10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液含雙抗(100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素)、無血清αMEM培養(yǎng)液含雙抗(100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)、胰酶、膠原酶、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)均由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院組織工程實驗中心提供;②TGF-β1購自美國Peprotech公司，北京中杉金橋生物技術有限公司代購，純度>98%;③人基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)酶聯檢測試劑盒(ELISA Kit)購自北京中杉金橋生物技術有限公司(預包被)。

1.2 實驗方法:

1.2.1細胞培養(yǎng):原代培養(yǎng)HPDLFs，取14歲男性青少年因正畸治療需要拔除的雙側下頜第一前磨牙。拔牙術前拍攝根尖X線片并進行詳盡的牙周檢查，確定該患者雙側下頜第一前磨牙發(fā)育完好，牙周組織健康。術后用PBS反復沖洗牙齒，刮取根中1/3處的牙周膜組織，眼科剪剪碎，至0.5～1mm大小，后用10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液沖洗已剝離組織3次;為使HPDLFs順利從組織塊中爬出，使用膠原酶消化20min，4×鏡下觀察見組織塊形態(tài)松散，終止消化，離心移去上清;提取組織，置于6孔板中，玻片加壓，加入適量10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液，后移至37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。每隔24h鏡下觀察細胞生長情況。當細胞自組織塊邊緣游出，成片生長至6孔板底面積80%時，進行傳代培養(yǎng)，每48h給細胞換液，取第5代細胞進行實驗。

1.2.2各實驗組及對照組細胞上清樣本收集:根據所購生物因子TGF-β1說明書指示，設立TGF-β1工作濃度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml，即為4個實驗組;采用0ng/ml TGF-β1為對照組。取傳代至第5代HPDLFs，消化重懸，接種于小方瓶中。將加有上述各濃度TGF-β1 10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液分別加至小方瓶，每瓶4ml，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。分別于細胞培養(yǎng)至4h、8h、12h、24h、48h各時間點收獲上清液，每組取200μl，后立即置入-20℃低溫冰箱凍存。

1.2.3雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測MMP-1含量:通過雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測各樣本上清中MMP-1含量。根據試劑盒說明書指示:抗人MMP-1單抗已包被于酶標板上(48孔 預包被);將ELISA檢測試劑盒中的標準品分別加入酶標板第1、2列;第2列為復本，以求減小誤差;通過倍比稀釋標準品建立標準曲線 (孔H1、H2為空白對照)。

將各實驗組、對照組樣本上清液按布孔設計依次添加至酶標板各孔，37℃孵育120min，洗板，濾干;加入一抗工作液，每孔50μl，37℃孵育60min，洗板，濾干;加入酶標抗體工作液，每孔100μl，37℃孵育60min，洗板，濾干;每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應7min;肉眼觀察酶標板已有顯色反應，每孔加入50μl終止夜終止反應;在492nm處測吸光值。以上各步驟均嚴格遵照檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4數據處理:使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包，將所測得MMP-1含量用多元線性回歸方法進行統(tǒng)計分析。

2結果

2.1 HPDLFs原代培養(yǎng)情況:原代培養(yǎng)細胞從組織塊中爬出時間為10～14天。鏡下觀察見:細胞以組織塊為中心，呈放射狀排列生長，局部形成生長暈，細胞呈長梭形或多突起星形，胞突細長，胞體豐滿，胞質均勻，核圓形或卵圓形，核仁清晰。由細胞形態(tài)和組織來源鑒定該細胞確為人牙周膜成纖維細胞。傳代后細胞生長旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定。

2.2 各實驗濃度TGF-β1對HPDLFs分泌MMP-1的影響:結果R2值為0.999，說明此次ELISA檢驗方法嚴格遵循操作步驟，結果真實可靠。選取由已建立標準曲線所得方程y= 0.197x2 + 0.775x-0.046。R2=0.999 作為標準方程，用Excel換算出酶標板各孔。

經由多元線性回歸分析得出，以0.05為檢驗水準，MMP-1分泌量與所設立TGF-β1作用時間梯度存在線性正相關關系。 線性方程:y=0.003+0.002x P=0.033<0.05，方程中y為各樣本上清液中MMP-1含量，x為時間。

3討論

正畸治療中牙齒移動是一個復雜的生物學過程，是不同組織、細胞和生物因子共同作用的結果[2-3]。HPDLFs是牙周膜中數量最多，功能最重要的細胞，參與牙周組織改建、再生。多種生長因子可通過不同的生物學機制調節(jié)HPDLFs的活性，進而影響牙周組織改建。

MMPs是一族鋅離子依賴性內肽酶，其主要功能在于降解細胞外基質(Extra Cellular Matrix，ECM)中的膠原、纖維連結蛋白等物質[3-4]。ECM的正常生理代謝依賴于MMPs及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)二者之間的動態(tài)平衡[5]。研究表明，膠原酶(MMP-1)和明膠酶(MMP-2、MMP-9)都是牙根吸收，牙周組織改建過程中的關鍵酶[6]。MMP-1由成纖維細胞、巨噬細胞、上皮細胞等多種細胞分泌，主要作用底物為I、II、III、VII、X型膠原，明膠，蛋白多糖等[4];在正畸治療牙齒移動過程中對ECM的合成、降解起重要調控作用。此過程中，首先由破牙骨質細胞分泌酸，使牙骨質脫礦，繼而通過分泌各種酶將殘留的有機物分解。牙周組織主要纖維成分中I型膠原纖維所占比例最多，少部分為III型[7]，這兩種膠原恰是MMP-1作用的底物;已建立的機械力所致牙根吸收的動物模型顯示MMPs的合成及分泌有所增加，其齦溝液中MMP-1、MMP-2及MMP-8的水平均高于正常[8];提示MMP-1對牙周組織的代謝有直接調控作用。此外MMP-1還是MMP-2等其他MMPs的啟動因子，它的活化可啟動一系列酶活性反應[4]，進而參與牙根吸收。

TGF-β1屬肝素生長因子家族，是一種具有多項調節(jié)功能的生物因子，在體內可同時調節(jié)多種相關蛋白的表達與分泌，影響多種細胞的生長、分化及功能[9]。研究表明，牙周膜發(fā)育過程中，TGF-β1及其受體在HPDLFs、成骨細胞和成牙骨質細胞內均有較強表達，提示TGF-β1參與牙周組織發(fā)育、改建等一系列過程，對ECM的合成和降解有重要調控作用[9]。

那么TGF-β1是通過什么途徑達到調控ECM代謝，進而影響牙周組織改建，參與牙根吸收的呢?MMP-1作為牙根吸收過程中最為重要的酶之一，其表達與分泌與牙根吸收的發(fā)生發(fā)展直接相關，它與TGF-β1有著什么樣的關系，MMP-1的分泌是否受到TGF-β1的調控呢?

本實驗通過設立TGF-β1對HPDLFs作用的濃度梯度和時間梯度，采用雙抗體夾心ELISA的方法檢測HPDLFs上清中MMP-1的分泌量，以驗證HPDLFs分泌MMP-1與TGF-β1的作用是否同時存在劑量依賴性和時間依賴性。結果表明，MMP-1分泌量與TGF-β1的作用時間總體上存在時間依賴性，具有統(tǒng)計學差異。P=0.033<0.05(如圖5，見表4);但不同作用時間下，各樣本中MMP-1含量與TGF-β1工作濃度并沒有顯示出一致的劑量依賴關系。具體分析如下:4h時各實驗組MMP-1的分泌量隨TGF-β1濃度的遞增有總體下降的趨勢(如圖6)。8h時各實驗組MMP-1的分泌量隨TGF-β1濃度的增加而遞增(如圖7)。12h時雖然0.07 ng/ml TGF-β1實驗組MMP-1分泌量較0.05ng/ml實驗組略有下降，但總體上MMP-1在細胞上清中的含量隨TGF-β1濃度的升高而升高(如圖8)。24h時各實驗組MMP-1分泌量同TGF-β1工作濃度呈正相關(如圖9)。48h時測得各組MMP-1含量變化較大，可能由于此時細胞培養(yǎng)時間已較長，細胞狀態(tài)已不穩(wěn)定所致(如圖10)。在8h、12h、24h時空白對照組MMP-1分泌量均高于TGF-β1最小實驗濃度組0.03ng/ml，推測 TGF-β1濃度為0.03ng/ml時可下調MMP-1表達或抑制其分泌。而當TGF-β1濃度≥0.05ng/ml時，MMP-1分泌量與TGF-β1濃度存在正相關關系。

綜上所述，HPDLFs分泌MMP-1與TGF-β1作用時間總體上存在時間依賴性，但在不同作用時間下HPDLFs分泌MMP-1對不同TGF-β1工作濃度并沒有表現出一致的劑量依賴關系。由于本研究樣本量較小，對于TGF-β1影響HPDLFs分泌MMP-1只能作一個初步的探尋性研究，更深入的探討需要在擴大樣本量后再繼續(xù)進行。

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[收稿日期]2009-11-20 [修回日期]2010-01-25

編輯/何志斌