[摘要]目的:探討IL-17mRNA在尋常型白癜風患者外周血中的表達及其臨床意義。方法:采用熒光實時定量RT-PCR方法對21例進展期白癜風患者、23例穩(wěn)定期白癜風患者及30例健康對照外周血IL-17mRNA含量進行檢測，并分析其表達水平與疾病病程與皮損面積的相關性。結果:進展期白癜風患者外周血IL-17mRNA的水平與健康對照組相比顯著升高(P<0.05)，穩(wěn)定期白癜風患者IL-17mRNA的水平與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。白癜風患者IL-17mRNA的含量與病程無相關性(r=0.15，P>0.05)，與皮損面積呈正相關(r=0.54，P<0.05)。結論:IL-17在白癜風發(fā)病過程中可能發(fā)揮一定的作用。

[關鍵詞]白癜風;IL-17;實時熒光定量PCR

[中圖分類號]R758.4+1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)02-0225-04

Serum level of IL-17mRNA in patients with vitiligo and its clinical significance

WANG Luan，YANG Hui-lan，F(xiàn)AN Jian-yong

(Department of Dermatology，the General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，Guangdong，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the level of IL-17mRNA in peripheral blood of patients with vitiligo.Methods21 cases of advanced vitiligo patients，23 cases of stable vitiligo patients and 30 healthy controls were enrolled in this study. The level of IL-17mRNAwas detectedby using real-time PCR andthe relevance with the course of disease andlesion area were conducted by correlation analysis using spss 13.0 software.ResultsThe level ofIL-17mRNA in the advanced vitiligowas significantly higher than those of healthy controls(P<0.05).There were no significantly difference between the stable vitiligo and health controls(P>0.05). The level of IL-17mRNAwas no correlation with the course of vitiligo(r=0.15，P>0.05)，and positively correlated with area of skin lesions(r=0.54，P<0.05).ConclusionIL-17may play a role in the pathogenesis of vitiligo.

Key words: vitiligo; IL-17; real-time fluorescence quantitative reversetranscriptase-polymerase chain reaction

白癜風是一種以黑素細胞特異性脫失為特征的皮膚病，其病因和確切發(fā)病機制至今尚不完全清楚，自身免疫學說受到越來越多的關注。Th17細胞是一類不同于Th1和Th2的CD4+T細胞亞群，此類細胞以分泌IL-17為主而得名。最近的研究表明，Th17細胞和自身免疫的發(fā)生密切相關，而其與白癜風的發(fā)病是否相關，目前尚無報道。故我們通過熒光實時定量PCR法檢測尋常型白癜風患者外周血IL-17mRNA含量，并分析其與病程和皮損面積的相關性來探討Th17細胞與白癜風的關系。

1材料和方法

1.1 研究對象:選取廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科門診2008年10月～2009年6月就診并確診為白癜風的44例患者，其中男23例，女21例，平均(30.3±9.6)歲，病程(2個月～10年)。對患者按文獻[1]進行分型、分期。其中進展期21例，穩(wěn)定期23例。泛發(fā)性5例，散發(fā)性21例，局限性12例，肢端性6例。皮損面積在25%及以下的37例，25%到50%的5例，50%以上的2例。所有患者均排除嚴重心腦血管疾病、肝腎疾病、感染、腫瘤及其它自身免疫性疾病，檢測前一個月未接受任何免疫治療。對照組30例均為本院健康體檢者，其中男17例，女13例，平均年齡(27.2±9.5)歲，與患者組在年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 主要儀器及試劑:淋巴細胞分離液:購自北京鼎國生物技術有限責任公司;RNA抽提試劑:Trizol，購自美國Invitrogen Life Technologies公司;定量檢測試劑盒:SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit，購自日本TaKaRa公司;ABI 7900 HT PCR儀:購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 引物合成及序列:IL-17及內參β-actin上下游引物委托TaKaRa生物公司設計合成。

IL-17上游引物:5'-CCACCTCACCTTGGAATCTC-3'

下游:5'-CAGGATCTATTGCTGGATGG-3' 產物長度:205bp

β-actin上游引物:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'

下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'產物長度:184bp

1.4 方法

1.4.1 RNA抽提及逆轉錄反應:采集患者及正常人外周靜脈血5ml，EDTA抗凝。用淋巴細胞分離液從外周血中分離淋巴細胞，然后Trizol抽提淋巴細胞總RNA，核酸測定儀測A260/A280，要求在1.8～2.0之間，同時1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量。逆轉錄反應:每10μl逆轉錄體系中加入上述總RNA200ng作為模板進行反應，逆轉錄條件:37℃15min，85℃5s。

1.4.2 SYBR熒光實時定量PCR:參照說明書設定的PCR程序:95℃10s變性，然后95℃5s，60℃30s重復40個循環(huán)進行擴增;設定熔解程序:95℃ 1min，65℃15s，從65℃緩慢升溫至95℃，每升高0.5℃檢測一次熒光信號值。反應結束儀器自動生成循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct值)及熔解曲線圖。每個樣本均設3個復孔，取其平均值進行比較，用IL-17和內參基因β-actin Ct值的差值(ΔCt)表示IL-17mRNA的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學分析:實驗結果用SPSS 13.0軟件處理，計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用方差分析，相關性檢驗采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 實時熒光定量PCR體系的確定:由目的基因IL-17mRNA和內參基因β-actin的擴增曲線和熔解曲線(圖1-4)可見，IL-17mRNA和β-actin的擴增效率恒定，且均已達到平臺期，;相應的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好;它們的熔解曲線均為單峰特異，引物的特異性好且無引物二聚體產生。故可以使用該體系對目的基因IL-17進行定量。

2.2 各組白癜風患者外周血IL-17mRNA表達量的比較:21例進展期白癜風、23例穩(wěn)定期白癜風和30例健康對照的IL-17mRNA表達量分別為3.232±1.137、1.672±0.896和1.432±0.954。進展期白癜風患者與健康對照相比，IL-17mRNA的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.43，P<0.05);進展期白癜風患者與穩(wěn)定期白癜風患者相比，IL-17mRNA的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.14，P<0.05);穩(wěn)定期白癜風患者與健康對照相比，IL-17mRNA的含量升高，但差異無統(tǒng)計學意義(t=1.25，P>0.05)。

2.3 白癜風患者IL-17mRNA表達量與病程及皮損面積的相關性:采用Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)，白癜風患者外周血中IL-17mRNA的含量與病程無相關性(r=0.15，P>0.05);白癜風患者外周血IL-17mRNA的含量與皮損面積呈正相關(r=0.54，P<0.05)。

3討論

當CD4+T細胞接受抗原刺激后，不同的細胞因子誘導其向不同的亞群分化。例如，當局部抗原遞呈細胞產生IL-12時，尤其在IFN-γ的共同作用下，CD4+T細胞分化為分泌IFN-γ的Th1細胞，促進細胞介導的免疫反應清除細胞內病原體;當局部IL-4存在時，CD4+T細胞分化為分泌IL-4、IL-5和IL-13的Th2細胞，促進體液免疫反應清除細胞外病原體。近期研究發(fā)現(xiàn)了CD4+T細胞的一種新的分化方向，在抗原遞呈細胞產生的TGF-β1、IL-6和IL-23的共同作用下，分化為Th17細胞，該細胞主要分泌IL-17。Th17細胞在正常免疫反應中的作用尚未知，但研究已發(fā)現(xiàn)其在清除特定感染源中發(fā)揮重要作用[2-3]。適當?shù)腡細胞免疫反應可有效清除病原體并產生記憶性T細胞，不適當?shù)腡細胞免疫反應或持續(xù)的T細胞亞群激活可導致自身免疫性或過敏性疾病，許多研究已證實過去認為是由Th1細胞介導的許多自身免疫性炎癥反應其實是由產生IL-17的Th17細胞介導的。IL-17是分子量為20～30ku的糖蛋白，是早期的炎癥因子，具有廣泛的生物學活性，它可刺激滑膜細胞、成纖維細胞、角質細胞、上皮及內皮細胞分泌各種細胞因子，如IL-6、IL-8、前列腺素E2、單核細胞化學趨化蛋白-1和粒細胞集落刺激因子等[4]。

熒光實時定量RT-PCR方法作為檢測mRNA表達的新技術，具有高靈敏性，實時監(jiān)測，定量準確等優(yōu)點，近年來廣泛應用于分子學領域的研究[5]。我們采用SYBR-GreenI熒光實時定量RT-PCR法檢測尋常型白癜風患者外周血淋巴細胞中IL-17mRNA的表達，該方法在應用過程中需結合熔解曲線分析來確定PCR產物的特異性[6]。本試驗通過熔解曲線分析，確定PCR產物特異性好。結果顯示進展期白癜風患者外周血淋巴細胞中IL-17mRNA的含量明顯高于健康對照，而穩(wěn)定期的患者IL-17mRNA的水平與健康對照無明顯差異，IL-17mRNA與白癜風的病程無相關性，但與白癜風的皮損面積呈正相關，表明IL-17可能參與了白癜風的進展過程，既往研究表明，在白癜風皮損周圍有淋巴細胞浸潤，局部的炎癥因子IL-6、IL-8可對黑素細胞有損傷作用。外周血中炎性細胞因子IFN-γ 、IL-6、IL-8水平升高[7]。IL-17可能通過刺激炎癥細胞產生上述炎癥因子而對黑素細胞產生損傷，從而導致白癜風的發(fā)病，而Th17細胞作為新的細胞亞群，是否參與白癜風的發(fā)病，尚需更多的研究。

綜上所述，白癜風發(fā)病機制目前尚未闡明，我們通過對IL-17mRNA在尋常性白癜風患者中的研究，為白癜風的免疫學發(fā)病機制提供了更多的證據，為以后提出新的治療方法提供路徑。

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[收稿日期]2009-12-18[修回日期]2010-01-29

編輯/張惠娟