摘 要:花粉管通道法介導(dǎo)韭菜轉(zhuǎn)基因尚處于研究階段，它是基因工程技術(shù)與常規(guī)雜交育種相結(jié)合的育種方法。本文詳盡介紹了外源DNA片段在韭菜基因組中整合的理論基礎(chǔ)和受精過程轉(zhuǎn)化的理論基礎(chǔ)，韭菜利用花粉管通道法轉(zhuǎn)基因的操作程序、影響因素及優(yōu)缺點和前景。

關(guān)鍵詞:花粉管通道法;韭菜;轉(zhuǎn)基因育種

中圖分類號:S633.3;Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2010)03-0008-03

韭菜，屬百合科，是原產(chǎn)于我國的多年生單子葉宿根蔬菜，抗寒﹑耐熱﹑適應(yīng)性強(qiáng)，在全國各地普遍栽種，是我國生產(chǎn)范圍最廣泛的香辛葉類蔬菜之一，經(jīng)濟(jì)效益十分可觀[1]。

花粉管通道法早在20世紀(jì)70年代末80年代初就已在遠(yuǎn)緣雜交中開始應(yīng)用，是基因工程技術(shù)與常規(guī)雜交育種相結(jié)合的方法[2]。它可以越過受體組織培養(yǎng)的過程，直接利用花粉粒為媒體，因此操作簡單﹑方便易行，而且所需儀器設(shè)備少，成本低廉。利用該法可加快韭菜新品種的選育進(jìn)程，改良其品質(zhì)，提高其產(chǎn)量，增強(qiáng)其抗性，從而有效防治病蟲害，減少使用化學(xué)藥劑引起的環(huán)境污染。

1 外源DNA片段在韭菜基因組中整合的理論基礎(chǔ)

從現(xiàn)代分子生物學(xué)水平看，植物DNA分子間常含有同源序列部分，韭菜DNA中就存在著大量高度重復(fù)序列，很多基礎(chǔ)代謝酶系的基因是一樣的。因此，外源植物DNA片段與韭菜基因組DNA雜交重組是有可能的。許多實驗證明，原生質(zhì)體直接吸收的DNA片段可以整合到核DNA。盡管目前對其整合機(jī)理尚不清楚，但大量實驗證據(jù)均表明外源DNA是可以整合到卵細(xì)胞核DNA的。

2 韭菜受精過程轉(zhuǎn)化的理論基礎(chǔ)

韭菜花呈傘狀花序，每一總苞一般有30～180朵小花，每朵小花有6片花瓣、6枚雄蕊，中央有1枚雌蕊。選擇花位較好的小花作為轉(zhuǎn)化對象。小花開放初期，柱頭針尖狀，2～3 d后柱頭伸長，頂端膨大，分三裂，并有黏液出現(xiàn)，此時是授粉的最佳時期[3]。傳粉完成后，花粉便在柱頭上萌發(fā)出花粉管，管內(nèi)產(chǎn)生雄性配子——精子，通過花粉管伸長，直達(dá)胚珠的胚囊內(nèi)部，與卵細(xì)胞和極核互相融合，這是有性生殖過程的重要階段。受精后胚珠進(jìn)一步發(fā)育為種子，受精極核發(fā)育成胚乳。受精過程的主要環(huán)節(jié)是花粉粒的萌發(fā)、花粉管的伸長和精卵細(xì)胞的融合。 由此，理論上可知:①滴注在柱頭上的外源DNA片段可以隨著花粉管進(jìn)入胚囊，因為花粉管是先進(jìn)入助細(xì)胞或胚囊后再破裂，所以外源DNA懸浮液不管在花粉管腔內(nèi)或腔外都可以進(jìn)入胚囊;②卵細(xì)胞在遠(yuǎn)離珠孔端，無細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜，進(jìn)入胚囊的精核先是染色體附著在核膜上，然后斷裂分散，并與卵核DNA融合;③在胚發(fā)育初期，即原胚期間細(xì)胞無厚的細(xì)胞壁，具有很強(qiáng)的分裂能力，并從胚囊中吸取營養(yǎng)物質(zhì)，外源DNA可被吸入這些細(xì)胞，參與核的融合;④花粉管導(dǎo)入外源DNA的關(guān)鍵在于掌握受精過程的時間。

3 花粉管通道法介導(dǎo)韭菜轉(zhuǎn)基因的操作程序

3.1 外源DNA制備

3.1.1 從供體中提取DNA ①提取供體的總DNA;②DNA純化，測定230、260、280 nm處的光吸收值，計算比值;③酶切:用核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ等酶切成片段;④DNA導(dǎo)入液:配制SSC溶液(0.15 mol/L NaCl，0.015 mol/L檸檬酸鈉，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH 7.0，高壓滅菌)，制備濃度為500～1 000 μg/ml的DNA導(dǎo)入液，用光譜掃描顯示出典型的核酸吸收圖譜，符合外源 DNA導(dǎo)入要求。

3.1.2 從細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA 可以直接從大腸桿菌中提取中介載體質(zhì)粒DNA，并酶切后制備符合要求的外源DNA導(dǎo)入液。

3.1.3 從重組Ti質(zhì)粒中獲得DNA 從農(nóng)桿菌中提取已重組構(gòu)建的Ti質(zhì)粒，獲得帶有npt-Ⅱ或gus等報告基因及目的基因的質(zhì)粒DNA，酶切后制備成符合要求的外源DNA導(dǎo)入液。

3.2 外源DNA導(dǎo)入的方法及時間

3.2.1 柱頭涂抹法 未授粉前，先用DNA導(dǎo)入液涂抹柱頭，再人工授粉，迅速套袋。

3.2.2 柱頭切除法 當(dāng)受體韭菜自花授粉一定時間后(一般2～3 h)，切去花柱，將DNA導(dǎo)入液滴于切口，迅速套袋，1 h后復(fù)滴1次。

3.2.3 花粉粒吸入法 提前去雄并套袋隔離，用DNA導(dǎo)入液處理花粉粒，使外源DNA進(jìn)入花粉粒，然后進(jìn)行人工授粉套袋。

各實驗均以不含DNA的等量SSC溶液作對照。

3.3 后代材料處理將獲得的韭菜子代點播在同一實驗田，進(jìn)行田間試驗，綜合考察以便獲得新品種。

3.4 轉(zhuǎn)基因目標(biāo)性狀的鑒定

轉(zhuǎn)基因后收獲的種子進(jìn)行鑒定時，必須以原韭菜受體品種為對照。程序如下:

(1)轉(zhuǎn)基因的受體韭菜上有標(biāo)記基因時，可進(jìn)行標(biāo)記基因的表達(dá)鑒定，具有速度快、費用低、可大大減少工作量的優(yōu)點。但應(yīng)注意，在長期研究中，存在著標(biāo)記基因表達(dá)與轉(zhuǎn)基因表達(dá)之間的不完全相關(guān)關(guān)系。

(2)生物學(xué)測定:針對轉(zhuǎn)基因后應(yīng)當(dāng)表達(dá)的表現(xiàn)型，直接應(yīng)用生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定以明確目的基因能否在受體韭菜中表達(dá)出目標(biāo)性狀及其表達(dá)水平，如抗蟲性等。

(3)目的基因及其表達(dá)的分子鑒定:采用PCR方法和Southern Blot方法進(jìn)行目的基因整合的分析，采用Western Blot等方法進(jìn)行目的基因在受體中表達(dá)及表達(dá)水平的分析。

(4)從分子基礎(chǔ)上明確轉(zhuǎn)基因插入韭菜受體基因組之后的存在狀態(tài)，為進(jìn)一步的分子遺傳研究提供依據(jù)。

4 韭菜花粉管通道法轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的影響因素及其優(yōu)缺點

4.1 韭菜花粉管通道法轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中的影響因素

(1)關(guān)鍵因素在于精確掌握韭菜的受精過程及時間規(guī)律;

(2)DNA導(dǎo)入液的濃度、pH值等;

(3)導(dǎo)入DNA的分子結(jié)構(gòu)及其片段大小。環(huán)狀分子難以轉(zhuǎn)化，大片段DNA轉(zhuǎn)化率低，片段太小不能保證完整基因存在，要選用大小適宜的DNA片段，這需要長期的實驗積累。

4.2 優(yōu)點

(1)利用韭菜的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA，無需細(xì)胞、原生質(zhì)體等的組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程。

(2)方法簡便，育種工作者易于掌握。

(3)育種時間縮短。在自花授粉的基礎(chǔ)上只有部分外源DNA片段進(jìn)入受體韭菜基因組，避免了供體基因與受體基因組全面重組，因而易于穩(wěn)定。

(4)可以任意選擇生產(chǎn)上的當(dāng)家品種進(jìn)行外源DNA的導(dǎo)入，達(dá)到目的性狀基因的轉(zhuǎn)移?？杀苊庖话闵锛夹g(shù)的實驗室研究與大田要求脫節(jié)的問題。

4.3 缺點

(1) 外源DNA片段的導(dǎo)入，可能帶入少量目的性狀基因以外的DNA片段。

(2) 該技術(shù)限于韭菜開花時(7月底～9月中旬)才能應(yīng)用。

(3)外源DNA能否與韭菜受體基因組整合，決定于目的性狀基因的結(jié)構(gòu)與功能是否與受體韭菜基因組和細(xì)胞代謝相容。不受單基因或單片段DNA控制的多基因性狀，不能或很難通過這一技術(shù)導(dǎo)入。

(4)外源基因的導(dǎo)入具有很大的隨機(jī)性，和染色體配對完全不同，應(yīng)根據(jù)導(dǎo)入受體韭菜植株的單株記錄，單株擴(kuò)種檢驗、繁殖獲得目的性狀的后代，必須從整體看是否符合育種要求。

5 結(jié)語

在20世紀(jì)70年代周光宇先生提出了DNA片段雜交假說[4]，并在80年代建立了利用花粉管通道法直接導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)。在隨后二三十年中，許多學(xué)者采用此技術(shù)開展了水稻[5，6]、小麥[7，8]、玉米[9]、大豆[10，11]、棉花[12，13]等多種農(nóng)作物改良研究，而且都有成功先例。花粉管導(dǎo)入外源DNA轉(zhuǎn)化韭菜的轉(zhuǎn)基因方法利用自身的生殖系統(tǒng)作為載體是得天獨厚的長處，可創(chuàng)造變異，優(yōu)化農(nóng)藝性狀，實現(xiàn)韭菜的分子育種，為韭菜育種提供新種質(zhì)，拓寬了韭菜的基因庫，為現(xiàn)階段韭菜育種增加了新技術(shù)新方法。相信隨著花粉管通道法在韭菜轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用研究進(jìn)一步深入，其必能在韭菜育種中發(fā)揮重要作用。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] 吳國興主編.韭菜保護(hù)地栽培[M].北京:金盾出版社，2001，1.

[2] Zhou G Y，Weng J，Zeng Y，et al.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos [J].Methods in Enzymology，1983，101:433-481.

[3] 尹守恒，劉宏敏，等編著.韭菜[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社，2007，23.

[4] 周光宇.從生物化學(xué)的角度探討遠(yuǎn)緣雜交的理論[J] .中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1978，2:16-20.

[5] 劉國華，陳立云，洪亞輝，等.外源DNA導(dǎo)入誘導(dǎo)水稻高蛋白質(zhì)變異的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，26(6):415-417.

[6] 李建粵，范士靖，鄒 征，等.大豆DNA導(dǎo)入引起稻米蛋白質(zhì)含量變異的遺傳穩(wěn)定性及賴氨酸含量分析[J].種子，2001，6:3-7.

[7] 王亞馥，陳克明，焦成瑾，等.外源DNA導(dǎo)入小麥后的變異系生物學(xué)特性及胚乳蛋白的研究[J].作物學(xué)報，1995，21(4):404-411.

[8] 朱新產(chǎn)，趙文明.豌豆花DNA導(dǎo)入小麥對籽粒蛋白質(zhì)的影響 [J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，23(2):103-105.

[9] 耿慶漢，張海明，莫力根，等.小麥DNA導(dǎo)入玉米引起性狀變異的研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院學(xué)報，1992，13(1):14-21.

[10]雷勃鈞，尹光初，盧翠華，等.外源DNA直接導(dǎo)入大豆的研究[J].大豆科學(xué)，1991，10(1):58-62.

[11]雷勃鈞，錢 華，李希臣，等.通過直接引入外源DNA育成高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高蛋白大豆新品種黑生101[J].作物學(xué)報，2000，26(6):725-730.

[12]黃駿麒，錢思穎，劉桂鈴，等.外源海島棉D(zhuǎn)NA導(dǎo)致陸地棉性狀的變異[J].遺傳學(xué)報，1981，8(1):56-62.

[13]龔蓁蓁，沈慰芳，周光宇，等.受粉后外源DNA導(dǎo)入植物技術(shù) [J].中國科學(xué)B輯，1988，6:611-614.