摘 要:本研究構(gòu)建了含馬鈴薯X病毒(PVX)衣殼蛋白(CP)基因的原核表達(dá)載體，利用在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的馬鈴薯X病毒CP制備了效價為1∶1 600的抗血清。該血清可用于馬鈴薯、番茄、辣椒和煙草等作物攜帶PVX情況的檢測。

關(guān)鍵詞:馬鈴薯X病毒;衣殼蛋白;原核表達(dá)載體;抗血清

中圖分類號:Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2010)03-0005-03

馬鈴薯X病毒(Potato virus X， PVX)是馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)的典型成員，最早由Smith于1931年在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，目前在世界各地均有發(fā)生[1]。PVX侵染馬鈴薯引起輕型花葉或隱癥，多年侵染則引起重型花葉或矮化，造成的產(chǎn)量損失為10%~80%。PVX在煙草上引起斑駁和壞死斑點，在番茄上引起花葉及矮化。當(dāng)PVX與馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、煙草脈斑駁病毒(Tobacco vein mottling virus，TVMV)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)復(fù)合侵染時會出現(xiàn)協(xié)生現(xiàn)象，導(dǎo)致更大的損失。

鑒于培育和種植無病毒種苗是防治病毒病最有效的措施之一，而以酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)為主的血清學(xué)方法是目前大規(guī)模檢測病毒時廣泛使用的方法，本研究構(gòu)建了含PVX 衣殼蛋白(CP)基因的原核表達(dá)載體，利用原核表達(dá)的PVX CP制備了抗血清。

1 材料與方法

1.1 材料

PVX分離物FX21由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒研究室采自山東費縣煙區(qū)，3次單斑分離純化后摩擦接種到心葉煙上[2]。原核表達(dá)載體pET-22b(+)、大腸桿菌Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)細(xì)胞均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院植物病毒室保存;RNA提取試劑盒TRIzol購自博大泰克公司;克隆載體pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司。其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

采用文獻(xiàn)[2]、[3]的方法，從發(fā)病煙草葉片中提取總RNA。以提取的總RNA為模板， 利用正向引物5′-GAGGATCCGTCAGCA′CCAGCTAGCACAAC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切序列)和反向引物5′-CGAAGCTTTTATGGTGGTGGTAGA

GTGAC-3′(下劃線為Hind Ⅲ的酶切序列)進(jìn)行RT-PCR，擴增PVXCP基因。PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海博亞有限公司測序。

測序證實無誤的重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Hind Ⅲ雙酶切后回收PVXCP基因片段，與經(jīng)相同酶切的pET-22b(+)連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒(pET-PVXCP)轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素50 μg/ml)，37℃活化過夜，1∶100稀釋到不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、227 r/min培養(yǎng)3 h，加IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度1 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h。離心收集菌體，加適量pH 8.0 TE溶液，振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)情況。

1.3 抗血清的制備及檢測

從凝膠中切取特異性表達(dá)的蛋白帶，加適量生理鹽水研磨后，用等量的弗氏不完全佐劑乳化。采用肌肉注射結(jié)合皮下注射免疫家兔，每隔1周免疫1次，共免疫5次。最后一次注射1周后耳靜脈采血，利用間接ELISA法測定抗血清的效價[3]。收集抗血清，分裝后-20℃貯存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVX CP基因的擴增及與質(zhì)粒載體的連接

RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離，利用DNA回收試劑盒回收大小約為760 bp的目的片段，與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在含100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選重組質(zhì)粒?？赡芎庠椿虻闹亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成的菌落為白色，無插入片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成的菌落為藍(lán)色。隨機挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒再通過測序證實序列沒有錯誤。

2.2 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

將經(jīng)測序證實成功插入PVX CP基因的重組質(zhì)粒(命名為pMD18-PVXCP)用BamHⅠ和HindⅢ酶切目的片段，電泳回收約760 bp的片段，將其與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切并回收的pET-22b(+)連接。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37℃恒溫箱培養(yǎng)12～16 h后可看到白色菌落。挑取單菌落培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒并用0.8%的瓊脂糖電泳檢測。對可能含有外源片段的質(zhì)粒(pET-PVXCP)用PCR和酶切兩種方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，PCR和酶切得到的片段與預(yù)期大小一致(圖1)，原菌落可供誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 PVX CP基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

將含有pET-PVXCP的BL21單菌落在5 ml含有氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按1∶100轉(zhuǎn)入100 ml不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)3 h后取菌液進(jìn)行分析。SDS-PAGE結(jié)果表明，在29 ku左右處有一蛋白帶(圖2)。本研究中表達(dá)的是PVX CP的融合蛋白，含有載體的幾十個氨基酸，因而分子量比正常的25 ku大。

2.4 抗血清制備

對實驗家兔進(jìn)行五次免疫后，耳靜脈取血，分離血清。在間接ELISA試驗中，當(dāng)抗血清稀釋1 600倍時可以從病株汁液中檢測出PVX，而當(dāng)抗血清稀釋3 200倍時，不能檢測出PVX，說明本研究中制備的抗血清效價為1∶1 600(表1)。在SDS-瓊脂免疫雙擴散試驗中，該抗血清與PVX毒原有沉淀反應(yīng)，而與健康對照沒有反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的蛋白制備了馬鈴薯X病毒的效價為1∶1 600的抗血清。該血清可用于馬鈴薯、番茄、辣椒和煙草等作物攜帶PVX情況的檢測。

ELISA是目前進(jìn)行病毒大規(guī)模檢測時最常用的方法。該方法快速靈敏， 但需大量高純度的特異性抗血清。利用提純的病毒粒子為抗原制備抗血清， 需要花費大量的人力、物力來繁殖和提純病毒，而且不能完全排除寄主蛋白可能帶來的影響。利用原核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物為抗原制備抗血清可避免寄主蛋白的影響，但這種方法制備的抗血清往往效價較低，而且通過SDS-PAGE純化制備的蛋白抗原可能與天然的寄主蛋白無反應(yīng)。本研究中制備的PVX抗血清可與天然蛋白反應(yīng)，而且已經(jīng)成功用于煙草病毒的檢測[4]。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] Bercks R. Potato virus X. Descriptions of plant viruses， No. 4[EB/OL]. Commonwealth Mycological Institute/Association of Applied Biologists， London，1970.

[2] Yu X Q， Wang H Y， Lan Y F， et al. Complete genome sequence of a Chinese isolate of potato virus X and analysis of genetic diversity[J]. Journal of Phytopathology，2008，156:346-351.

[3] 蘭玉菲， 劉金亮，高 瑞，等. 煙草脈帶花葉病毒CP基因的原核表達(dá)及抗血清制備[J].植物病理學(xué)報，2007，37(5):461-466.

[4] 陳秀齋，溫 亮，魏代福，等. 蒙陰煙草病毒種類檢測[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，10:62-63.