摘 要:采用盆栽受控試驗法，設置無鹽脅迫(0.046%)、輕度鹽脅迫(0.2%)和重度鹽脅迫(0.5%)3個鹽分水平，研究了不同鹽分下叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi， AMF)對紫花苜蓿(Medicago sativa L.)生長量和耐鹽性的影響。結果表明，隨鹽脅迫程度的增加，相同AMF 處理的紫花苜蓿生長量顯著降低(P<0.05)，葉片游離脯氨酸、丙二醛含量和膜透性顯著增加(P<0.05);與低AMF處理相比，3個鹽分水平下高AMF處理的紫花苜蓿的生長量都顯著增加(P<0.05)，紫花苜蓿葉片游離脯氨酸、丙二醛含量和膜透性都顯著降低(P<0.05)，表明AMF能增加紫花苜蓿的耐鹽性，緩解鹽脅迫對紫花苜蓿生長的影響。

關鍵詞:鹽脅迫;叢枝菌根真菌(AMF);紫花苜蓿

中圖分類號:S551+.7 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)03-0032-06

鹽漬化是自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在的一種脅迫生境條件，全球鹽漬化土地約占耕地總面積的10%，山東省鹽漬土總面積為140×10⁴ hm²，約占全國鹽堿地面積的6%。土壤鹽漬化嚴重制約著農業(yè)生產，影響了資源與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是重要的豆科牧草，其營養(yǎng)、飼用價值居于各種牧草之首，同時葉片具有排鹽機制，具有較強的耐鹽性[1～3]，在沿海灘涂地區(qū)廣泛分布，是改良鹽堿地的理想材料。如何利用和開發(fā)鹽漬化土壤，提高鹽脅迫下紫花苜蓿的耐鹽性和產量日益受到重視[4～6]。

叢枝菌根真菌(AMF)廣泛存在于鹽漬化土壤生態(tài)環(huán)境，陸地生態(tài)系統(tǒng)中約90%的高等植物都能與之形成菌根共生體[7]。很多研究表明，AMF能降低植物根系pH值，增加土壤團粒結構，降低鈉離子對植物的毒害，促進宿主植物生長，提高其適應鹽脅迫的能力[8～12]。鹽脅迫條件下，AMF 對植物的促進作用被認為是對植物形態(tài)、生理和生物化學等多方面影響的綜合結果[13]。前人圍繞紫花苜蓿耐鹽品種的篩選展開深入細致的研究，以提高紫花苜蓿鹽脅迫下的產量[1～3]，但至于AMF能否提高紫花苜蓿耐鹽性鮮見報道。本試驗研究了不同鹽分水平下AMF對紫花苜蓿生長的影響，以期能為AMF在改良鹽漬土壤中的應用以及提高牧草在鹽堿土壤中的產量提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用紫花苜蓿(Medicago sativa L.)來自中國農業(yè)科學院畜牧研究所，挑選籽粒飽滿、健康無病蟲害種子，用 1%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后分別用自來水和蒸餾水沖洗3次。

供試土壤取自浙江省上虞市沿海灘涂(30.121°N，120.666°E)，有機質含量4.85 g/kg，全氮0.084 g/kg，有效磷23.41 mg/kg，速效鉀231.10 g/kg，pH 8.54。

1.2 試驗方法

試驗設兩因子(鹽分含量和AMF)，鹽分設3個水平:土壤本底水平即無鹽脅迫(0.046%)，輕度鹽脅迫(0.2%) 和重度鹽脅迫(0.5%);AMF設2個水平:高AMF和低AMF處理，用殺真菌劑苯菌靈處理原土壤，獲得低AMF處理的土壤[14]。每個處理重復4次，共有24個盆缽，完全隨機排列。

試驗于浙江大學網室條件下進行，自然溫度、光照條件，水分人工控制。采用盆栽受控試驗的方法，盆缽的規(guī)格為長44 cm，寬31 cm，高12 cm。每盆缽裝土20 kg(土層約厚10 cm)，在第一次澆灌時注入淡水。待滲透均勻后，于2009年4月15日按照紫花苜蓿最適種植密度(300 株/m²)播種[15]，播種后35 d對各處理進行加鹽處理:鹽分以海鹽精(購自浙江水產公司)的形式添加，其成分與海水中的各種成分接近，加入海鹽精使土壤含鹽量分別達到0.2%和0.5%，從而獲得輕度鹽脅迫處理和重度鹽脅迫處理。

1.3 測定指標和方法鹽脅迫處理后65 d，采用10 cm×10 cm 的樣方對各個處理進行取樣測定[16]。測量株高、冠幅和地上生物量干重:用稱量法;

分枝數(shù)，復葉葉片數(shù)，樣方內存活植株數(shù)目:用計數(shù)法;

小葉葉面積:采用王旺田等的改進方法測定[17];

葉片游離脯氨酸含量:采用茚三酮比色法測定[18];

葉片丙二醛含量:采用硫代巴比妥酸反應法測定[18];

葉片細胞膜透性:參考白寶璋電導法[19]。

1.4 數(shù)據處理與統(tǒng)計分析

個體平均生物量干重 = 樣方地上總生物量干重 / 樣方內存活植株數(shù)目。

采用 SPSS 13.0 對數(shù)據進行二元方差分析，在α = 0.05 的顯著性水平下利用LSD 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 AMF在不同鹽濃度下的侵染率

圖1顯示，施加苯菌靈顯著降低了AMF對紫花苜蓿的侵染率，從而形成低AMF處理(F= 6078.42， P<0.05)，而不施加苯菌靈的處理則形成高AMF處理。

2.2 不同鹽濃度下AMF對紫花苜蓿生長量的影響

由表1、表2可以看出，隨鹽脅迫程度的增加，相同AMF處理的紫花苜蓿株高、冠幅、個體平均生物量干重、葉片數(shù)、分枝數(shù)和葉面積都顯著降低(P<0.05)，表明鹽脅迫抑制紫花苜蓿的生長。在不同鹽濃度下，高AMF處理的紫花苜蓿的生長量都大于低AMF處理，其中冠幅、個體平均生物量干重、葉片數(shù)、葉面積和分枝數(shù)顯著增加(P<0.05)，這表明鹽漬條件下AMF對紫花苜蓿生長有促進作用。AMF對紫花苜蓿生長的促進作用隨鹽脅迫程度的增加而減弱，鹽水平和AMF對冠幅、分枝數(shù)和個體平均生物量干重的交互作用顯著(P<0.05)(表2)，這表明AMF對紫花苜蓿生長的促進作用受鹽脅迫的影響。

2.3 不同鹽濃度下AMF對紫花苜蓿葉片抗逆性的影響

2.3.1 不同鹽濃度下AMF對紫花苜蓿葉片游離脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物體內最為有效的滲透調節(jié)物質之一，在逆境脅迫下細胞游離脯氨酸含量增加，有利于維持細胞膨壓，保護酶和細胞膜系統(tǒng)免受毒害。由圖2可知，低AMF處理紫花苜蓿葉片游離脯氨酸含量從無鹽脅迫下的15 μg/g增加至重度鹽脅迫下的59 μg/g，增加了2.9倍，高AMF處理紫花苜蓿葉片游離脯氨酸含量從無鹽脅迫下的11.5 μg/g增至重度鹽脅迫下的42.4 μg/g，增加了2.7倍。相同AMF處理，隨鹽脅迫程度的增加，葉片游離脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)(表2)，表明紫花苜蓿受鹽害影響隨鹽脅迫程度增加而增加。在不同鹽濃度下，高AMF處理的紫花苜蓿葉片游離脯氨酸含量都明顯小于低AMF處理(P<0.05)(圖2，表2)，這表明AMF能有效減輕紫花苜蓿地上部分受鹽脅迫的程度。Sharifi等(2007) [20]的研究結果表明，AMF能增加根內的脯氨酸含量，調節(jié)地下部分的滲透平衡，從而減少了地上部分受脅迫的損害程度，降低地上部分脯氨酸含量，本試驗的研究結果與上述結論基本一致。

2.3.2 不同鹽濃度下AMF對紫花苜蓿葉片丙二醛含量的影響

植物在逆境脅迫下，產生的氧自由基增多，引起膜脂的過氧化，丙二醛是膜脂過氧化作用的最終分解產物，丙二醛又可以與膜上的蛋白質、酶等結合，引起蛋白質分子內和分子間的交聯(lián)，使之失活，因此丙二醛含量的多少間接地反映膜系統(tǒng)受鹽害的程度。圖3可見，隨鹽脅迫程度的增加，低AMF處理紫花苜蓿葉片丙二醛含量從無鹽脅迫下的0.058 μmol/g增加至重度鹽脅迫下的0.117 μmol/g，高AMF處理紫花苜蓿葉片丙二醛含量從0.041 μmol/g(無鹽脅迫)增加至0.09 μmol/g(重度鹽脅迫)。相同AMF處理，葉片丙二醛含量隨鹽脅迫程度的增加而顯著增加(P<0.05)(表2)，表明膜系統(tǒng)受傷害的程度增加。在不同鹽濃度下，高AMF處理的紫花苜蓿葉片丙二醛的含量都顯著小于低AMF處理(P<0.05)(表2)，降幅分別為29%(無鹽脅迫)，24%(輕度鹽脅迫)，20%(重度鹽脅迫)(圖3)，表明AMF有效保護紫花苜蓿的膜系統(tǒng)，從而增加了紫花苜蓿的耐鹽性。

2.3.3 不同鹽濃度下AMF對紫花苜蓿葉片膜透性的影響

相同AMF處理，隨鹽脅迫程度的增加，葉片膜透性顯著增加(P<0.05)，在高AMF處理下增幅為75%，在低AMF處理下增幅為59%，在不同鹽濃度下，高AMF處理的紫花苜蓿葉片膜透性都顯著小于低AMF處理(P<0.05)，降幅在無鹽脅迫下為23%，在輕度鹽脅迫下為21%，在高度鹽脅迫下為16%(圖4，表2)。在鹽脅迫下，紫花苜蓿葉片細胞膜穩(wěn)定性較弱，容易受到傷害，膜透性隨鹽害程度的增加而增加，而在不同鹽濃度下，高AMF處理葉片膜透性都顯著小于低AMF處理，

表明AMF能有效減輕鹽脅迫對紫花苜蓿葉片細胞膜的損害，從而增強紫花苜蓿適應鹽脅迫環(huán)境的能力。

3 討論與結論

在鹽脅迫下，植物體由于大量失水而產生滲透脅迫，植物細胞的滲透調節(jié)作用是植物適應環(huán)境，提高抗性的基礎[21]。脯氨酸是植物在鹽脅迫下的一種重要的滲透調節(jié)物質，劉友良等(1987)[22]認為受鹽脅迫的植物細胞能通過合成脯氨酸來調節(jié)滲透壓。脯氨酸的積累量隨植物體受鹽害程度的增加而增加[23]。因此葉片游離脯氨酸變化可以視為紫花苜蓿對鹽脅迫的一種生理響應，是紫花苜蓿的自衛(wèi)反應之一[24，25]。本試驗中，紫花苜蓿葉片脯氨酸含量隨鹽濃度增加而逐漸提高(圖2)，而在不同鹽濃度下，高AMF處理的紫花苜蓿葉片游離脯氨酸都顯著小于低AMF處理(圖2，表2)，說明AMF能夠顯著增強紫花苜蓿的耐鹽性，這與高AMF處理紫花苜蓿的生長量大于低AMF處理的研究結果一致(表1，表2)。

植物膜系統(tǒng)通常被認為是植物對鹽脅迫響應的最初和最關鍵的部位，因此很多學者圍繞鹽脅迫對細胞膜系統(tǒng)的影響進行了大量研究[26，27]。鹽脅迫引起植物膜系統(tǒng)受到傷害， 主要是由于細胞自由基代謝平衡遭到破壞，引發(fā)或加劇膜脂過氧化，導致質膜選擇透性遭到損傷，大量離子外滲，丙二醛是膜脂過氧化的終產物。植物膜系統(tǒng)的損傷引起一系列生理生化變化，造成代謝紊亂，使植物遭到傷害[28]。本試驗中，紫花苜蓿葉片丙二醛含量和膜透性隨鹽濃度增加而逐漸提高(圖3，圖4，表2)，表明隨鹽脅迫程度的加劇，紫花苜蓿葉片膜脂過氧化反應加快，膜系統(tǒng)受傷害的程度加重。高AMF處理紫花苜蓿葉片丙二醛含量和葉片膜透性都顯著小于低AMF處理(圖3，圖4，表2)，說明AMF能夠顯著增強紫花苜蓿的耐鹽性，減輕紫花苜蓿受鹽害的程度，增強紫花苜蓿在鹽脅迫下的適應性，因此在不同鹽濃度下，高AMF處理的紫花苜蓿生長量都顯著高于低AMF處理(表1，表2)。

叢枝菌根真菌(AMF)促進植物生長的主要機制是其菌絲能促進植物對土壤營養(yǎng)元素的吸收，逆境條件下AMF引起宿主植物生理水平的變化也同樣能影響植物生長 [20]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下AMF降低了紫花苜蓿葉片游離脯氨酸、丙二醛含量和膜透性，從而促進紫花苜蓿生長，與前人研究結果一致。前人研究還表明，AMF 能調節(jié)植物體內的激素水平[29]。閆明等(2007)[30]發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫條件下接種AMF 能提高樟樹葉片細胞分裂素的含量，從而提高植物抗鋁毒的能力。劉潤進等(2000)[31]研究發(fā)現(xiàn)，AMF 能顯著提高玉米和棉花植株葉片和根內玉米素、生長素和赤霉素含量，并降低脫落酸含量，從而促進了干旱條件下植物的生長。本試驗的結果表明，3個鹽分條件下，AMF促進了植物的分枝數(shù)、葉片數(shù)，而植物分枝和葉片的生長發(fā)育與細胞分裂素密切相關[32]。因此，高AMF 處理紫花苜蓿分枝數(shù)的增加是否由于AMF影響了細胞分裂素水平還有待證實。

AMF對紫花苜蓿生長的促進作用受鹽脅迫的影響(表1，表2)，這可能是因為隨鹽濃度的提高，AMF的侵染率顯著下降(P<0.05)(圖1，表2)，AMF的功能受到抑制。因此 AMF對紫花苜蓿生長的促進作用隨鹽脅迫程度的增加而減弱。

Ruiz-Lozano 和Azcon(1995)認為[33]，叢枝菌根真菌(AMF)能夠增強植物的耐鹽性，提高其生產力，因而在實際生產上AMF 可以作為一種潛在的生物因子加以開發(fā)利用。隨鹽脅迫程度增加，AMF 侵染率降低[34～38]。本試驗結果也表明，高鹽脅迫抑制菌根的作用，目前尚未有報道表明AMF 能對鹽脅迫產生適應性，使其功能的發(fā)揮不受鹽脅迫影響。但是盆栽試驗表明[20]，與不經鹽預處理相比，經鹽預處理的AMF 對宿主植物的促進作用有一定程度增加， 而且不同AMF菌株對鹽脅迫的響應以及對植物的促進程度不同，因此研究AMF 對鹽脅迫的適應性及其機理，并篩選出具有較強適應能力的AMF 菌株將具有很好的實際應用價值。

綜合本試驗的研究結果，分析認為:鹽脅迫能抑制紫花苜蓿的生長，而AMF能增強紫花苜蓿的耐鹽性，促進紫花苜蓿在鹽漬環(huán)境中的生長。這一研究結果為AMF在鹽漬化土壤中的應用提供了理論依據。

參 考 文 獻:

[1] 田瑞娟，楊靜慧，梁國魯，等. 不同品種紫花苜蓿耐鹽性研究[J]. 西南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2006，28(6):933-936.

[2] 杜長城，楊靜慧，任慧朝，等. 不同品種紫花苜蓿的耐鹽性篩選試驗[J]. 天津農業(yè)科學， 2008，14(5):14-16.

[3] 韓德梁，韓烈保，周曉靜. 中苜一號紫花苜蓿耐鹽性研究[J]. 種子，2008，27(6):1-4.

[4] 桂 枝，高建明，袁慶華. 鹽脅迫對紫花苜蓿品質的影響[J]. 天津農學院學報，2008，15(2):7-10.

[5] 吳保慶，郭洪海. 煙氣脫硫石膏對鹽脅迫下紫花苜蓿生理的影響[J]. 山東農業(yè)科學，2008，2:45-47.

[6] 苗錦山，賈春林，楊秋玲，等. 不同播種量對鹽堿地紫花苜蓿生育和產量的影響[J].華北農學報，2009，24(B08):309-311.

[7] Smith S E， Read D J. Mycorrhizal Symbiosis(2nd edition)[M]. California: Academic Press，1997.

[8] Heijden M G A， van der，Klironomos J N， Ursic M， et al. Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity， ecosystem variability and productivity[J]. Nature，1998，396:69-72.

[9] 劉潤進，李曉林. 叢枝菌根及其應用[M]. 北京: 科學出版社， 2000.

[10]王樹和，王曉娟，王 茜，等. 叢枝菌根及其宿主植物對根際微生物作用的響應[J]. 草業(yè)學報，2007，16(3):108-113.

[11]Clark R B. Arbuscular mycorrhizal adaptation， spore germination， root colonization， and host plant growth and mineral acquisition at low pH[J]. Plant and Soil，1997，192:15-22.

[12]張美慶. 略論VA菌根在我國的應用[J]. 華北農學報，1998，13(1):106-111.

[13]Porras-Soriano A， Soriano-Martín M L， Porras-Piedra A， et al. Arbuscular mycorrhizal fungi increased growth， nutrient uptake and tolerance to salinity in olive trees under nursery conditions[J]. Journal of Plant Physiology， 2009， 166:1350-1359. [14]Helgason T， Merryweather J W， Young J P W， et al. Specificity and resilience in the arbuscular mycorrhizal fungi of a natural woodland community[J]. Journal of Ecology，2007，95(4):623-630.

[15]李明芳，張尚寧. 紫花苜蓿種植密度試驗研究[J]. 陜西農業(yè)科學，2007，1:62-63.

[16]Shumway D L， Koide R T. Size and reproductive inequality in mycorrhizal and nonmycorrhizal populations of Abutilon theophrasti[J]. Journal of Ecology，1995，83:613-620.

[17]王旺田，馬靜芳，張金林，等. 一種新的葡萄葉面積測定方法[J]. 果樹學報，2007，24(5):709-713.

[18]張治安，張美善，蔚榮海. 植物生理學實驗指導[M]. 北京:中國農業(yè)技術出版社，2004.

[19]白寶璋.植物生理生化測試技術[M]. 北京: 中國科技出版社，1995.

[20]Sharifi M， Ghorbanli M， Ebrahimzadeh H. Improved growth of salinity-stressed soybean after inoculation with salt pre-treated mycorrhizal fungi[J]. Journal of Plant Physiology，2007，164:1144-1151.

[21]Moran J F， Becana M， Iturke O I， et al. Drought induces oxidative stress in pea plants[J]. Plant， 1994， 94:346-352.

[22]劉友良，毛才良.植物耐鹽性研究進展[J]. 植物生理學通訊，1987，4:1-7.

[23]駱建霞，申屠雅瑾，張津華，等. 鹽脅迫對海姆維斯蒂枸子生長及丙二醛和脯氨酸含量的影響[J]. 天津農學院學報，2008，15(4):8-11.

[24]湯章城.逆境條件下植物游離脯氨酸的累積及其可能的意義[J].植物學生理學通訊，1984，4:27-32.

[25]Greenway H， Munns R. Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes[J]. Annual Review of Plant Physiology，1980，31:149-190.

[26]邱 收，于曉英，謝明亨，等. 鹽脅迫對萱草細胞膜透性和滲透調節(jié)物質的影響[J]. 信陽農業(yè)高等?？茖W校學報，2008，18(2):115-117.

[27]王文斌，金潤熙，鄧西平，等. 苜蓿幼苗芽、根器官對鹽脅迫的生理生化響應[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版)，2009，37(5):217-223.

[28]Elstner E F. Oxygen activation and oxygen toxicity [J]. Annual Review of Plant Physiology，1982，33:73-96.

[29]Allen M F， Moore T S， Christensen M. Phytohormone changes in Bouteloua gracilis infected by vesicular- arbuscular mycorrhizae. I. Cytokinin increases in the host plant [J]. Canadian Journal of Botany，1980，58:371-374.

[30]閆 明，鐘章成. 鋁脅迫對感染叢枝菌根真菌的樟樹幼苗生長的影響[J]. 林業(yè)科學，2007，43(4):59-65.

[31]劉潤進，李 敏，孟祥霞，等. 叢枝菌根真菌對玉米和棉花內源激素的影響[J]. 菌物系統(tǒng)，2000，19(1):91-96.

[32]Cline M G. Apical dominance [J].Botanical Review，1991，57:318-358.

[33]Ruiz-Lozano J M， Azcon R. Hyphal contribution to water uptake in mycorrhizal plants as affected by the fungal species and water status[J]. Physiologia Plantarum，1995，95(3):472-478.

[34]Guttay A J R. Impact of deicing salts upon the endomycorrhizae of roadside sugar maples[J]. Soil Science Society of America Journal，1976，40:952-954.

[35]Ojala J C， Jarrell W M， Menge J A， et al. Influence of mycorrhizal fungi on the mineral nutrition and yield of onion in saline soil[J]. Agronomy Journal， 1983， 75: 225-259.

[36]Aliasgharzadeh N， Rastin S N， Towfighi H， et al. Occurence of arbuscular mycorrhizal fungi in saline soils of the Tabriz plain of Iran in relation to some physical and chemical properties of soil[J]. Mycorrhiza，2001，11:119-122.

[37]Rabie G H， Almadini A M. Role of bioinoculants in development of salt-tolerance of Vicia faba plants under salinity stress[J]. African Journal of Biotechnology，2005，4(3):210-222.

[38]Juniper S， Abbott L K. Soil salinity delays germination and limits growth of hyphae from propagules of arbuscular mycorrhizal fungi[J]. Mycorrhiza，2006，16(5):371-379.