摘要:目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬PBD-1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，為穩(wěn)定生產(chǎn)豬PBD-1并將其應(yīng)用于新型獸藥的開(kāi)發(fā)提供生產(chǎn)細(xì)胞源。方法:真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-PBD-1經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞，通過(guò)不同濃度的G418加壓篩選，和進(jìn)一步采用單個(gè)克隆法篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的marc-145細(xì)胞系，用RT-PCR及抑菌試驗(yàn)檢測(cè)PBD-1的表達(dá)。結(jié)果:建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的marc-145細(xì)胞系，成功地表達(dá)目的基因，其培養(yǎng)上清液及細(xì)胞凍融液具有抑菌作用。結(jié)論:利用真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-PBD-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究豬PBD-1的生物學(xué)特性及其在獸用生物制品上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:豬β防御素l;真核表達(dá)載體;marc-145細(xì)胞;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

中圖分類號(hào):S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1007-273X(2010)04-0008-03

傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用導(dǎo)致耐藥菌株大量產(chǎn)生，特別是多重耐藥菌的出現(xiàn)給感染性疾病的治療帶來(lái)了許多新的問(wèn)題，因此尋找和開(kāi)發(fā)無(wú)耐藥性的新型抗菌藥物對(duì)于畜牧業(yè)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。近年來(lái)在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的防御素類物質(zhì)就具有這種特殊的抗菌活性，Ganz等[2]將其命名為防御素

(Defensins)。豬的β防御素l(porcine β defensin 1，PBD-1)廣泛分布于肝、呼吸道、胸腺、脾臟、臍帶等多種組織細(xì)胞內(nèi)，在豬防御系統(tǒng)中有重要作用，既可用作畜禽飼料添加劑，也可用于食品保鮮劑，還可開(kāi)發(fā)成新的廣譜抗菌藥物[3]，因此豬防御素的成功獲取能帶來(lái)極大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。但是，豬體內(nèi)天然防御素表達(dá)量低、分子小，分離困難，化學(xué)合成防御素成本又太高，所以利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)外源基因已成為獲取目標(biāo)蛋白的有效途徑之一[3-7]。本研究將豬PBD-1真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞，通過(guò)單克隆篩選，建立了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究豬PBD-1的生物學(xué)特性及其在獸用生物制品上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和篩選試劑G418均由Invitrogen公司生產(chǎn);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清由Gibco公司生產(chǎn);胰蛋白酶、PBS等為國(guó)產(chǎn)。限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamH I、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit均購(gòu)自華美生物工程公司;RNeasy Mini RNA 提取試劑盒由Qiagen(德國(guó))公司生產(chǎn);蛋白胨和酵母浸提液來(lái)自O(shè)xoid公司;引物由上海生物工程公司合成。

1.2菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸桿菌DH5α為本室保存，質(zhì)粒pMD18-T 由TaKaRa公司提供。質(zhì)粒載體pIRES2-EGFP-PBD-1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8]。marc-145細(xì)胞購(gòu)自武漢中博生物股份有限公司，在本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.3建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬PBD-1的marc-145細(xì)胞系

將復(fù)蘇后傳代3次的marc-145細(xì)胞以胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)成5×105個(gè)/mL的密度，接種于若干個(gè)直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，按照Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，對(duì)照組不加脂質(zhì)體。6h后更換有血清、無(wú)雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，開(kāi)始用G418篩選。過(guò)程為:頭3d 1 000μg/mL，接著用2 000μg/mL的濃度繼續(xù)篩選，直至絕大部分細(xì)胞死亡，將G418濃度改為1 000μg/mL維持篩選6周。將獲得細(xì)胞采用極限稀釋法傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔大約1個(gè)細(xì)胞，交替使用常規(guī)培養(yǎng)基和G418(1 000μg/mL)培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，至其長(zhǎng)出單個(gè)克隆。在熒光顯微鏡下挑選出最優(yōu)的細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)，并不斷擴(kuò)繁至建立新的細(xì)胞系。

1.4RT-PCR檢測(cè)目的基因PBD-1

收集空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及PBD-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 按RNeasy Mini RNA說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA。將DU640核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度RNA稀釋至1μg/μL。cDNA第一鏈的合成的反應(yīng)體系是50μL，將已稀釋RNA各取2μL(含RNA2μg)于滅菌的Ep管中，加入10μmol/L的oligod(T)11.5μL，加DEPC處理H2O至總體積15μL?；靹蛏晕㈦x心，于70℃溫育5min以解除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，立即置于冰上防止二級(jí)結(jié)構(gòu)的重新生成。然后加入35μL的其他組分，包括:M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(40U)1μL，5×RT緩沖液10μL，dNTP(10mmol/L)2.5μL，RNAase抑制劑(40U)1μL和DEPC處理H2O 20.5μL，混勻離心， 置37℃溫育1h，95℃，5min滅活。反轉(zhuǎn)錄的cDNA 于-20℃保存。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)。在25μL反應(yīng)體系中加入cDNA模板5μL，10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP(25mmol/L) 1.0μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，Taq DNA多聚酶0.25μL，H2O補(bǔ)足至25μL，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4min;94℃ 40s;56℃退火35s;72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán);72℃繼續(xù)延伸10min。取等體積RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并照像。

上游引物:5'-CGGAATTCATGAGACTCCACCGCCTC-3'，下游引物:5'-CGGGATCCCTTCTGAGCCATATCTGTG-3'。

1.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的功能驗(yàn)證

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌的抑制效果。設(shè)置雙抗組(青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL)、細(xì)胞上清液組、無(wú)雙抗培養(yǎng)基組。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-PBD-1的酶切鑒定

將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒用EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切，可以得到約5.3kbp和252bp片段(圖1)，與理論設(shè)計(jì)相符，再經(jīng)PCR鑒定，仍擴(kuò)增出252 bp片段(圖2)，進(jìn)一步證實(shí)了陽(yáng)性重組質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast軟件比對(duì)分析，上述結(jié)果與NCBI公布序列(序列號(hào)NM_213838)100%一致(含信號(hào)肽序列)，表明構(gòu)建載體成功。

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-PBD-1的PCR鑒定

利用PCR方法從提取的質(zhì)粒中擴(kuò)增PBD-1基因(引物見(jiàn)1.4)，電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期的結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的PBD-1基因含有該基因完整的編碼區(qū)序列，也包含信號(hào)肽序列(圖2)，可用于下一步轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

2.3pIRES2-EGFP-PBD-1重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞及表達(dá)產(chǎn)物功能驗(yàn)證

pIRES2-EGFP-PBD-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染marc-145細(xì)胞，通過(guò)單克隆培養(yǎng)，獲得4個(gè)100%具有綠色熒光表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆株。至發(fā)稿時(shí)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均已傳代20次以上。在倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)明亮的綠色熒光(圖3)。此外，上清液抑菌試驗(yàn)表明，marc-145轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)產(chǎn)物能夠顯著抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)(表1)。

3 討論

哺乳動(dòng)物的防御素可以抗細(xì)菌、真菌、被膜病毒等多種微生物，尤其是對(duì)支原體、衣原體、螺旋體以及一些惡性細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)和艾滋病病毒有殺傷作用[9]，極有可能成為新一代抗菌藥物的理想選擇[10]。豬β-防御素作為防御素家族重要成員，具有極高的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。但豬體內(nèi)天然β-防御素表達(dá)量低、分子小，分離困難，化學(xué)合成防御素成本又太高，所以利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)外源基因已成為獲取目標(biāo)蛋白的最有效途徑之一[3-7]。

本研究中采用的pIRES2-EGFP是一帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)編碼基因的真核載體[11]。EGFP是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度，且熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性強(qiáng)，目前得到廣泛應(yīng)用。pIRES2-EGFP還含有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子和SV40 poly A加尾信號(hào)，前者可增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，后者可增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄效率。該載體還攜帶新霉素抗性基因，提供了G418篩選的標(biāo)志，便于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選。本研究將PBD-1 cDNA插入到表達(dá)熒光蛋白的pIRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)處，通過(guò)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增和單酶切、雙酶切鑒定，成功的構(gòu)建了含有PBD-1目的基因和熒光蛋白報(bào)告基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-PBD-1。它的應(yīng)用可以使轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時(shí)表達(dá)PBD-1和綠色熒光蛋白，所以它不僅能導(dǎo)入外源性PBD-1，而且可利用熒光蛋白的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行直觀、及時(shí)的觀察和檢測(cè)。

此外，經(jīng)典途徑分泌的細(xì)胞因子其基因序列中都含有前導(dǎo)的信號(hào)肽序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)經(jīng)由高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑分泌。本研究中克隆的豬PBD-1包含起始密碼子、終止密碼子和信號(hào)肽。信號(hào)肽的存在保證了表達(dá)產(chǎn)物正常分泌到胞外。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的豬PBD-1基因真核表達(dá)載體經(jīng)酶切鑒定、序列分析完全正確，并在marc-145細(xì)胞上驗(yàn)證了該載體的有效性，最終通過(guò)單克隆培養(yǎng)，獲得了4株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PBD-1的細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究豬PBD-1的生物學(xué)特性及其在獸用生物制品上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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