中圖分類號(hào):S828.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):1007-273X(2010)04-0004-04

第六講豬的胚胎移植技術(shù)

豬的胚胎移植是指將一頭母豬的早期胚胎取出，移植到另一頭生理狀態(tài)相同的母豬生殖道內(nèi)，使之發(fā)育成為新個(gè)體的技術(shù)，又稱之為“人工受胎”或“借腹懷胎”。提供胚胎的個(gè)體稱為供體，接受胚胎的個(gè)體稱為受體。一頭剛剛出生的母豬卵巢上有數(shù)以萬計(jì)的卵母細(xì)胞，但終其一生能發(fā)育成熟、排卵、受精并形成新個(gè)體的是極少數(shù)。如果應(yīng)用胚胎移植并結(jié)合超數(shù)排卵技術(shù)，則可以使其繁殖的效率提高幾倍甚至幾十倍。如果說人工授精是提高良種公豬繁殖力的有效方法，那么胚胎移植則為提高良種母豬的繁殖力提供了新的技術(shù)途徑。

豬胚胎移植試驗(yàn)成功最早于1951年由Kvashickii報(bào)道。到20世紀(jì)60年代，已經(jīng)基本建立了外科手術(shù)方法采集和移植胚胎的技術(shù)。由于豬是多胎動(dòng)物，繁殖力較高，用胚胎移植技術(shù)從少數(shù)優(yōu)良個(gè)體獲得較多后代的要求不像牛羊那么迫切，因而一定程度上制約了胚胎移植技術(shù)在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。盡管如此，到70年代以后，北美和歐洲也開始將胚胎移植技術(shù)應(yīng)用于向閉鎖豬群引進(jìn)外血和國際間的引種。近年來，豬的胚胎移植技術(shù)日趨成熟，成功率大大提高，國內(nèi)外已開始應(yīng)用于良種豬和特殊品種豬的繁殖和育種。

豬胚胎移植的基本技術(shù)程序包括:供、受體的同步發(fā)情，供體的超數(shù)排卵和配種，胚胎的采集，胚胎的質(zhì)量鑒定，胚胎的短期培養(yǎng)和胚胎的移植。如圖5所示。

有關(guān)同步發(fā)情和超數(shù)排卵技術(shù)，本講座的第一、二講已有詳細(xì)介紹。本講從“胚胎的采集”開始敘述。

1胚胎移植前的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作

1.1集卵管的制備

用于輸卵管沖卵的集卵管，長130～140mm、壁厚0.8～1.1mm、內(nèi)徑3～4mm的玻璃管;用于子宮角沖卵的集卵管，外徑10mm、長130～140mm的玻璃管;兩種玻璃管均在酒精噴燈上中間彎成120°～140°角，兩端燒制、研磨平滑。

1.2揀卵管和移卵管的制備

揀卵管和移卵管相同，在酒精燈上拉制內(nèi)徑為300～400μm的玻璃吸管，如圖6所示。

1.3表面皿的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備直徑為8～10cm的表面皿，做為沖卵時(shí)接收沖卵液用。每個(gè)供體豬需備2～4個(gè)皿，寫好編號(hào)，放入培養(yǎng)箱待用。

1.4移植套管的制作

移植套管可用比移卵管前部略粗、外徑3mm、長約4cm的塑料細(xì)管，紫外燈下滅菌備用。

1.5手術(shù)器材的準(zhǔn)備

將手術(shù)所需要的器材(手術(shù)刀、手術(shù)剪、止血鉗、持針鉗、巾鉗、縫合針、縫合線、創(chuàng)巾、沙布、表面皿、揀卵管、沖卵管等)高壓滅菌。臨手術(shù)時(shí)將金屬器械浸泡在0.1%新潔爾滅液中備用。

1.6沖卵液的配制

在試劑公司購置成品PBS或DPBS粉劑，按其說明書用雙蒸水配制。

1.7培養(yǎng)液的配制

短暫培養(yǎng)可以用沖卵液，但需加入10%的小牛血清。用0.22μm的濾膜過濾滅菌，然后分裝保存，待用。

1.8手術(shù)室的準(zhǔn)備

豬場開展胚胎移植工作，人工受精的精液處理室即可代替手術(shù)室。每次手術(shù)之前，手術(shù)室需用福爾馬林熏蒸消毒。通氣之后，再用紫外燈照射。

2胚胎的采集

2.1采集的時(shí)間

根據(jù)采胚部位的不同，可分為輸卵管采胚和子宮角采胚。如果從輸卵管采胚，應(yīng)在最后一次配種的48h內(nèi)進(jìn)行;如果從子宮角采胚，則應(yīng)在最后一次配種的48～120h進(jìn)行，同時(shí)應(yīng)注意不同發(fā)育時(shí)間胚胎在子宮角所處的部位。供體豬采胚手術(shù)前應(yīng)停食12h。

2.2供體豬的麻醉和保定

供體豬上腭牽拉，限制活動(dòng)，將戊巴比妥鈉(2.5%)按20～30mg/kg體重或水合氯醛硫酸鎂注射液(水合氯醛8%，硫酸鎂5%)150～200mL耳靜脈注射，進(jìn)行全身麻醉。由于個(gè)體之間對(duì)麻醉藥的敏感性不同，所以在注射時(shí)要隨時(shí)觀察豬的神態(tài)，注射的速度要慢，防止過量。一般在眼瞼剛剛失去反應(yīng)，蹄部刺激無明顯反射時(shí)即可。

麻醉到位后仰放在手術(shù)保定架上，四肢固定。為防止手術(shù)過程中豬的掙扎、動(dòng)彈，要用繩索將四肢和頭部捆綁牢靠。為使腹腔內(nèi)臟向前傾斜，方便手術(shù)，手術(shù)臺(tái)要前低(頭低)后高(尾高)。手術(shù)過程根據(jù)需要肌肉或靜脈滴注適量的鹽酸氯胺酮。

2.3手術(shù)部位及其消毒

用肥皂水和毛刷洗刷術(shù)部，水洗后用毛巾揩干凈。手術(shù)部位一般選擇在倒數(shù)第2、3個(gè)乳頭之間，先用電剪或毛剪在術(shù)部剪毛，應(yīng)剪凈毛茬，用清水洗凈術(shù)部，然后涂以2%～4%的碘酒，再用70%～75%的酒精棉脫碘。消毒程序是:碘酊棉球→酒精棉球，由內(nèi)向外。蓋創(chuàng)巾于術(shù)部，使預(yù)定的切口暴露在創(chuàng)巾開口的中部。

2.4手術(shù)方法

沿腹中線，盡量避開血管，切開皮膚5～8cm，鈍性分離脂肪和肌肉層，使腹膜露出后，用鈍頭剪刀剪開腹膜。術(shù)者將食指及中指由切口伸入腹腔，在與骨盆腔交界的前后位置觸摸子宮或子宮角，摸到后用二指夾持，牽引至創(chuàng)口的表面。循一側(cè)子宮角導(dǎo)出輸卵管及卵巢，觀察卵巢表面排卵點(diǎn)和卵泡發(fā)育。

2.5輸卵管采胚

將集卵管一端由輸卵管傘部的喇叭口插入約1～2cm，用大拇指和食指固定，另一端接表面皿。用注射器吸取37℃的沖卵液15～20mL，在宮管結(jié)合部將針頭朝輸卵管方向插入，推注射器，沖卵液由宮管結(jié)合部流入輸卵管，經(jīng)輸卵管流至表面皿。

再將另一側(cè)輸卵管引出切口之外，用同樣的方法沖胚。

2.6子宮角采胚

根據(jù)沖卵時(shí)間的不同，在距宮管接合部30～70cm的子宮角背面沒有血管的部位用眼科剪剪個(gè)小孔，插入子宮角集卵管，開口向?qū)m管結(jié)合部方向，另一端開口接表面皿或平皿。用注射器從宮管結(jié)合部向子宮角注入30～50mL沖卵液。沖卵液流經(jīng)子宮角，將胚胎帶入接卵的表面皿或平皿。鑒于子宮角過長，也可以采取分段沖卵的方法。

再將另一側(cè)子宮角引出切口之外，用同樣的方法沖胚。

2.7揀卵

將接卵的表面皿置于顯微鏡下，用低倍鏡的大視野在沖卵液中找到胚胎。豬胚胎直徑為150μm左右，肉眼觀察只有針尖大小，為一球形體，在鏡下呈圓形，其外層是透明帶。揀卵管先吸入少許PBS再吸入卵，依次在第二個(gè)表面皿內(nèi)重復(fù)沖洗，然后把全部卵集中到一個(gè)表面皿，一只供體的卵放在一個(gè)皿內(nèi)。操作室溫為20～25℃。

2.8供體的術(shù)后處理

供體采胚完畢后，用37℃滅菌生理鹽水濕潤子宮，沖去凝血塊，將器官復(fù)位。腹膜、肌肉縫合后，涂抹磺胺等消炎防腐藥。皮膚縫合后，在傷口周圍涂碘酒，肌注青、鏈霉素。

3胚胎的質(zhì)量檢查及短期培養(yǎng)

3.1胚胎的質(zhì)量檢查

在顯微鏡下觀察胚胎的形態(tài)、卵裂球大小與均勻度、色澤、細(xì)胞密度、與透明帶間隙以及細(xì)胞變性等情況。正常發(fā)育的胚胎，其卵裂球一般外形整齊清晰，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。對(duì)發(fā)育正常的胚胎供移植或體外培養(yǎng)，淘汰未受精卵及發(fā)育異常的胚胎。不同發(fā)育階段的早期胚胎以及異常卵的形態(tài)見圖7、圖8。

3.2胚胎的短期培養(yǎng)

發(fā)育正常的胚胎如不馬上移植，可做短期培養(yǎng)。將胚胎放入用培養(yǎng)液制成的懸滴內(nèi)，每個(gè)懸滴可放5～10枚胚胎;然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。這種方法可培養(yǎng)1～2d。如需較長時(shí)間的培養(yǎng)，則要更換培養(yǎng)基。

4胚胎移植

4.1移植的部位與數(shù)量

胚胎移植的手術(shù)過程與胚胎采集一樣。一般來講，如果不加培養(yǎng)，從輸卵管沖出的胚胎應(yīng)移入受體的輸卵管內(nèi)，從子宮角沖出的胚胎應(yīng)移入受體的子宮角內(nèi)。如果是經(jīng)過培養(yǎng)的胚胎，或體外生產(chǎn)的胚胎，則要根據(jù)胚胎發(fā)育的階段，移入相應(yīng)的部位。

由于豬是多胎動(dòng)物，至少要移入4枚以上的胚胎，才能產(chǎn)生足夠的妊娠信號(hào)，使胚胎著床。一次移入15枚左右發(fā)育正常的胚胎，可以確保正常的受孕率的產(chǎn)仔數(shù)。而移入20枚以上的胚胎，既不會(huì)提高受孕率，也增加不了產(chǎn)仔數(shù)，反而浪費(fèi)取之不易的胚胎。移入10枚以下的胚胎，受孕率和產(chǎn)仔數(shù)都將受到影響。

4.2吸卵的方法

移卵管吸取胚胎時(shí)要采用三段式，即氣泡—卵—?dú)馀?，如圖9所示:

4.3輸卵管移植

受體按供體的手術(shù)方法麻醉保定后切口，將輸卵管和卵巢引出切口之外。先將移植套管從輸卵管傘口插入輸卵管至壺腹部，然后將吸有胚胎的移卵管插入套管，再將套管退出一部分，最后將移卵管內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液吹入輸卵管內(nèi)。移植完畢，小心將移卵管和套管退出，復(fù)原輸卵管傘。移卵之后的移卵管吸取PBS，置于顯微鏡下，檢查有無余卵。若發(fā)現(xiàn)有未移入卵，要重復(fù)上述步驟，移到另外一側(cè)輸卵管。確定管內(nèi)無余卵后，即可將卵巢、輸卵管或子宮角清洗，送入腹腔，縫合術(shù)部，涂碘酊，腹腔注射抗生素。

由于豬著床前的早期胚胎，從輸卵管進(jìn)入子宮角后是游動(dòng)的，最后會(huì)基本按等距離排列著床于兩側(cè)的子宮角內(nèi)，因此移入一側(cè)的輸卵管內(nèi)即可。

4.4子宮角移植

手術(shù)使子宮角露出切口之外。把位于宮管接合部約5cm處的子宮角下方的子宮系膜用拇指和食指牢牢固定，避開血管，用鈍針垂直于表面刺入到子宮角內(nèi)腔，制成小孔。再將預(yù)先吸有胚胎的移卵管從小孔插入子宮角腔內(nèi)，將胚胎注入子宮腔內(nèi)。

4.5受體母豬的管理

移植后的受體母豬，最初幾天，要注意每天兩次注射抗菌素，防止創(chuàng)口感染。同時(shí)，要單欄飼養(yǎng)，以防止豬只之間打架，弄破傷口或流產(chǎn)。受體母豬的營養(yǎng)水平，按懷孕母豬的日糧配合即可。懷孕中后期，注意補(bǔ)充青飼料，做好觀察。

5豬胚胎移植的效率

豬胚胎移植的效率受操作人員技術(shù)熟練程度的影響?，F(xiàn)將湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所開展的豬胚胎移植情況介紹如下。

5.1胚胎采集的效率

從表8可見，輸卵管采胚的獲胚率接近100%，且明顯高于子宮角。

5.2胚胎移植的效率

從表9可見，輸卵管移植的受孕率和產(chǎn)仔數(shù)略低于子宮角移植，但兩者的差異不顯著;接近正常配種的水平。

5.3關(guān)于供體的重復(fù)利用

供體母豬只有能重復(fù)利用，才能使優(yōu)良母豬的繁殖效率得到提高。供體母豬能否重復(fù)利用，一是取決于超排后激素的殘留及影響，二是取決于外科手術(shù)的影響。PMSG的半衰期為8～10d，HCG的半衰期為12～36h。董偉先生研究了PMSG在體內(nèi)的存留期，測定的結(jié)果表明一般在10d左右。連續(xù)3次(間隔35d)注射PMSG，血液中未檢測出PMSG的抗體。因此，PMSG的適量使用，一般不影響下一個(gè)情期的正常發(fā)情。豬手術(shù)取卵切口較小，一般不超過10cm，只要按規(guī)定的程序處理，5～7d內(nèi)即可完全愈合。筆者觀察了56頭湖北白豬青年母豬，在超排并手術(shù)取卵后，有52頭在17～20d發(fā)情，配種后正常受孕和產(chǎn)仔。

綜上可見，豬胚胎移植技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了實(shí)用的水平。

6胚胎移植技術(shù)在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

在以下幾方面，豬的胚胎移植技術(shù)具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。

6.1應(yīng)用胚胎移植技術(shù)對(duì)優(yōu)良母豬實(shí)施頻密產(chǎn)仔

以遺傳性能優(yōu)良的母豬做供體，雜交母豬、地方母豬或其他不能留做種用的母豬為受體，實(shí)施頻密產(chǎn)仔?？刹捎脙煞N繁殖模式。

(1)一年產(chǎn)4胎的繁殖模式:保守的做法，可將胚胎移植與自然發(fā)情配種相結(jié)合，如圖10所示。這樣的繁殖模式可使優(yōu)良母豬每年繁殖4胎，可增加產(chǎn)仔數(shù)16頭左右，提高優(yōu)良母豬的繁殖力將近一倍。

(2)一年產(chǎn)9胎的繁殖模式:優(yōu)良母豬只做供體，專事提供胚胎，每兩個(gè)情期超排、沖卵一次，全年可提供9窩胚胎，移植給9頭受體，獲其后代72頭左右，提高繁殖力3.0～3.5倍。

6.2特殊品種的快速擴(kuò)繁

某些特殊品種豬，例如:香豬，版納豬，五指山豬，野豬等，普遍繁殖力很低，一般產(chǎn)仔數(shù)在4～6頭左右，應(yīng)用胚胎移植技術(shù)可大大提高其繁殖力。以特殊品種豬做供體，其他品種或雜交豬做受體，可以大大加速特種豬的繁殖。

6.3地方豬的品種改良

目前，地方豬的品種改良，普遍采用引進(jìn)良種公豬與地方母豬雜交的方式，得到的后代為雜種豬，不能做種用。如果采用胚胎移植的方式，以良種豬做供體，地方母豬做受體，得到的后代即為純種豬，從而大大加快改良的進(jìn)程。

6.4豬的MOET育種

超數(shù)排卵與胚胎移植(MOET)是一項(xiàng)日趨成熟的胚胎工程技術(shù)，而且近年來對(duì)其在家畜育種中應(yīng)用的研究與實(shí)踐不斷深入。通過MOET可使供體的繁殖后代增加2～5倍。據(jù)報(bào)道，應(yīng)用MOET育種技術(shù)，動(dòng)物生長性狀的年遺傳進(jìn)展可比正常繁殖法提高70%～80%。

6.5用胚胎的運(yùn)輸代替種豬的運(yùn)輸

目前豬場引進(jìn)種豬，不僅耗費(fèi)昂貴的運(yùn)輸費(fèi)，運(yùn)輸過程中種豬應(yīng)激、減重、死亡也不可避免，更重要的危害還在于各種病原的傳播，給豬場帶來損失。用胚胎的運(yùn)輸代替種豬的運(yùn)輸，能有效地克服上述缺陷，不僅可以節(jié)省開支，而且可防止各種病原的傳播。

(全文完)