摘要:沙門氏菌是一種常見的重要人獸共患病原菌，介紹了其病原學(xué)、分類、危害及原因以及目前國(guó)內(nèi)外對(duì)沙門氏菌檢測(cè)方法的最新進(jìn)展，主要包括:以抗體為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法、以核酸為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法、PCR-ELISA技術(shù)，并把它們和傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。

關(guān)鍵詞:沙門氏菌;檢測(cè);ELISA;PCR

中圖分類號(hào):S854.4+3;S855.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):1007-273X(2010)01-0010-03

隨著近年來世界范圍內(nèi)的食品安全惡性事件屢屢發(fā)生，食品污染與食源性疾病構(gòu)成了一個(gè)巨大且不斷擴(kuò)大的世界性公共衛(wèi)生問題，直接關(guān)系到人們的身體健康和社會(huì)穩(wěn)定，并且正成為阻礙國(guó)際食品貿(mào)易發(fā)展的重要因素。由于傳統(tǒng)感染源普遍存在，新感染源不斷出現(xiàn)以及食品工業(yè)過程復(fù)雜化、人們飲食習(xí)慣的改變、人口流動(dòng)性增加等因素，使感染的流行模式發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為食物中毒通常迅速大面積暴發(fā)，給人類的食品安全和健康帶來威脅，同時(shí)也給食源性疾病的控制和預(yù)防帶來新的挑戰(zhàn)[1]。在各種畜產(chǎn)品中，細(xì)菌性食物中毒最為常見，而由沙門氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。動(dòng)物性產(chǎn)品中含有多種豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，非常適宜于沙門氏菌的生長(zhǎng)繁殖，人們一旦攝入了含有大量沙門氏菌的動(dòng)物性產(chǎn)品，就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素的作用下發(fā)生食物中毒。沙門氏菌不僅危害人類健康還會(huì)給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此加強(qiáng)畜產(chǎn)品衛(wèi)生安全，防止沙門氏菌污染，不僅是發(fā)展畜牧業(yè)的需要，也是減少人類沙門氏菌食物中毒，保護(hù)人民群眾身體健康的重要措施。了解沙門氏菌的概況，有助于對(duì)其檢測(cè)，從而保證畜產(chǎn)品的質(zhì)量，有利于畜牧業(yè)的發(fā)展和人的健康。

1病原學(xué)

沙門氏菌屬腸桿菌科，為革蘭氏染色陰性桿菌，絕大多數(shù)有鞭毛并能運(yùn)動(dòng)。菌體溶解時(shí)，其細(xì)胞壁所含的脂多糖釋放出來，形成內(nèi)毒素[2]。已證實(shí)，一些沙門氏菌含有攜帶耐藥因子的遺傳質(zhì)粒(質(zhì)粒是染色體外的遺傳物質(zhì)，易于從一細(xì)胞向另一細(xì)胞傳遞)。耐藥因子傳遞的對(duì)多種抗生素的耐藥性，可在敏感的細(xì)菌中散播，給治療沙門氏菌感染造成困難。

沙門氏菌廣泛存在于自然界，在溫度7～45℃的條件下均可生長(zhǎng)，以35～37℃最為適宜，但對(duì)高熱、直接陽光照射及常用消毒藥均敏感，60℃時(shí)15min可將其殺滅[2]。

2分類

沙門氏菌的正式分類和命名始于1934年，主要有兩種分類系統(tǒng)，即尤因的分類和考夫曼―懷特的分類。按照考夫曼―懷特的分類，已確認(rèn)的沙門氏菌屬有2 000多個(gè)血清型，根據(jù)沙門氏菌抗原結(jié)構(gòu)的不同，可分為A、B、C、D、E……等34個(gè)組。引起人類疾病的絕大多數(shù)屬于A～E組。其中主要有豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸類沙門氏菌、雞沙門氏菌、鴨沙門氏菌等10多個(gè)血清型。沙門氏菌依據(jù)其對(duì)宿主的感染范圍可分為宿主適應(yīng)血清型和非宿主適應(yīng)血清型兩大類。前者除對(duì)其適應(yīng)的宿主有致病性外，很少使其他宿主發(fā)病。如馬流產(chǎn)沙門氏菌、羊流產(chǎn)沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌;后者則對(duì)多種宿主有致病性，如鴨沙門氏菌、紐波特沙門氏菌、田納西沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等。

3沙門氏菌的危害

沙門氏菌不僅危害人類健康，還會(huì)給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。由沙門氏菌引起的疾病主要分為兩大類:一類是傷寒和副傷寒，另一類是急性腸胃炎。如鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等污染動(dòng)物性產(chǎn)品，進(jìn)而引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌。沙門氏菌污染主要來源于患病的人和動(dòng)物及其帶菌者，主要由其糞便、尿、乳汁以及流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和飼料等，其中飼料和水源的污染是導(dǎo)致沙門氏菌傳染的主要原因。畜禽感染沙門氏菌可引起相應(yīng)的傳染病，如豬霍亂、雞白痢等。一般情況下畜禽腸道帶菌率比較高，當(dāng)動(dòng)物因患病、衰弱、營(yíng)養(yǎng)不良、疲勞以致抵抗力降低時(shí)，腸道中的沙門氏菌即可經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)和組織進(jìn)入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，豬霍亂沙門氏菌可引起仔豬副傷寒，急性病例出現(xiàn)敗血癥變化，死亡率相當(dāng)高。慢性病例產(chǎn)生壞死性腸炎，影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育。雞白痢沙門氏菌，主要侵害雛雞，引起敗血癥，可造成大批死亡。在成年母雞則主要引起卵巢炎，可在卵黃內(nèi)帶菌而傳給幼雛。沙門氏菌引起的食物中毒一般在5~10月份最易發(fā)生。人食用沙門氏菌污染的食物后，一般8~24h后發(fā)病，潛伏期最短2h，長(zhǎng)者可達(dá)72h。主要有三種表現(xiàn)類型，即胃腸炎型、傷寒型、敗血癥型。以胃腸炎型最為常見[2]。

3.1胃腸炎型

多在食用被污染的食物8～24h后發(fā)病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹脹等，隨后出現(xiàn)腹瀉。腹瀉特點(diǎn)是1d為數(shù)次至20次不等，黃綠色稀水便、帶有惡臭，便中有不消化食物、黏液，偶爾有膿血。一般中等發(fā)熱，可伴有畏寒。健康的成年人，癥狀持續(xù)2～5d后可恢復(fù)，而年老體弱者則可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。嘔吐、腹瀉嚴(yán)重者，則可發(fā)生嚴(yán)重脫水。極少數(shù)嚴(yán)重患者有呈霍亂樣暴發(fā)性胃腸炎，因劇烈嘔吐、腹瀉而脫水，電解質(zhì)紊亂，很快會(huì)出現(xiàn)尿少、尿閉等等。嚴(yán)重者，特別是兒童、老年人和體弱者常因脫水、酸中毒、無尿、心力衰竭等，急救不及時(shí)而危及生命。

3.2傷寒型

多由豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等引起，出現(xiàn)類似于傷寒的表現(xiàn)。不同于傷寒的是病情較輕，病程相對(duì)短，一般為1～3周;雖腹瀉明顯，但很少并發(fā)腸出血和腸穿孔。

3.3敗血癥型

多發(fā)生于兒童或原有慢性疾病的成年人。各種沙門氏菌均可引起，但豬霍亂沙門氏菌經(jīng)口進(jìn)入后，早期即侵入血流，而腸道常無病變。起病通常急驟，病人有高熱、畏寒、出汗、乏力等表現(xiàn)，持續(xù)數(shù)天、1周或更長(zhǎng)時(shí)間。部分患者可出現(xiàn)腸道外部位的局灶性感染，如關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦膜炎、腎盂腎炎等。

4檢測(cè)方法概述

自19世紀(jì)后期沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原菌以來，檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床標(biāo)本的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床標(biāo)本的方法是相同的，此后人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟，一般都要經(jīng)過五個(gè)步驟:(1)前增菌;(2)選擇性增菌;(3)選擇性平板分離;(4)生化鑒定;(5)血清學(xué)鑒定。需時(shí)共約4~7d，雖然這種方法特異性較好，但費(fèi)力、耗時(shí)。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近10~15年間發(fā)展了很多改進(jìn)方法，其中許多可在48h內(nèi)檢出沙門氏菌，即我們所說的“快速檢測(cè)”[3]。現(xiàn)將國(guó)內(nèi)外有關(guān)的沙門氏菌快速檢測(cè)方法介紹如下。

4.1以抗體為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法

已建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法有許多種，大致可分為酶標(biāo)抗體(ELISA)、熒光抗體染色(免疫熒光法)[4]、同位素標(biāo)記抗體(放射免疫)[5]為基礎(chǔ)的方法及其他多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法。但最廣泛應(yīng)用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。黎兆滾等人首次在國(guó)內(nèi)口岸系統(tǒng)應(yīng)用微量板ELISA法對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)[3]。該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應(yīng)后再加入一定的指示劑，作用完畢后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值來判定結(jié)果。此法的樣品制備過程需要24h，檢測(cè)本身需要2h(30min是操作時(shí)間，90min是孵育時(shí)間)。國(guó)外很多已商業(yè)化的試劑盒也是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的[6]。例如美國(guó)Biocontrol公司的VIP免疫擴(kuò)散試劑條，即以?shī)A心型免疫色譜反應(yīng)為基礎(chǔ)。反應(yīng)固相包括一塊用“沙門氏菌抗體—染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條。抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應(yīng)區(qū)上，增菌后液體加到反應(yīng)小孔內(nèi)令其吸收，若樣品中存在沙門氏菌抗原，即會(huì)與偶合物作用，依次遷移到膜上，與固定在膜上反應(yīng)區(qū)的抗體結(jié)合，在反應(yīng)窗上呈現(xiàn)一條色帶。最后結(jié)果可在5~7min內(nèi)讀取。再如澳大利亞的Tecra系列也是基于夾心ELISA基礎(chǔ)上的快速檢測(cè)食品中沙門氏菌的試劑盒。包括前增菌和檢測(cè)總需時(shí)間約24h。而美國(guó)的VIDAS則是基于酶聯(lián)熒光免疫分析基礎(chǔ)上的自動(dòng)化分析系統(tǒng)。美國(guó)Biocontrol公司的I-2Test是一種快速定性檢測(cè)運(yùn)動(dòng)性沙門氏菌的試劑盒，14~30h即可看出免疫條帶(陽性)。自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀是用酶熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗后，通過激發(fā)光源檢測(cè)，即能讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本。其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，無傳染性，檢測(cè)速度快[7]。自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀靈敏度高，特異性強(qiáng)，可避免人為因素造成的假陰性，且能在短時(shí)間內(nèi)快速篩去大量的陰性樣品。檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)方法大為縮短，但由于目前其耗材較為昂貴，在實(shí)際應(yīng)用中難以大面積推廣。

4.2以核酸為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法

生物中的核酸(DNA或RNA)是一類可以決定遺傳信息的大分子。由于所有生物都含有這種分子，可以利用它作為檢測(cè)的標(biāo)靶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外酶促基因擴(kuò)增技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將靶DNA(或RNA)擴(kuò)增數(shù)百萬倍[8]。PCR和DNA探針雜交聯(lián)合使用來檢測(cè)食品中沙門氏菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)[9]。探針的標(biāo)記方法有放射性同位素、地高辛、生物素等。美國(guó)的Biocontrol公司的產(chǎn)品Probelia Salmonella[10]就是一種基于PCR擴(kuò)增和DNA分子雜交技術(shù)的特異性檢測(cè)食品中沙門氏菌的自動(dòng)化裝置。Gene-Trak公司也開發(fā)有檢測(cè)沙門氏菌的商業(yè)化系統(tǒng)，此法針對(duì)沙門氏菌核糖體RNA設(shè)計(jì)一段寡核苷酸探針，用于雜交檢測(cè)。美國(guó)Qualicon公司生產(chǎn)的BAX系統(tǒng)也是利用PCR擴(kuò)增目標(biāo)病原菌特異DNA片段至可檢測(cè)水平，因其他微生物沒有相同特定DNA片段，則不被擴(kuò)增，故該系統(tǒng)具有很高專一性，靈敏度也很高，食品中致病菌細(xì)胞數(shù)僅為1cfu/25g時(shí)均可被檢出。1995年，美國(guó)PE公司研制出熒光PCR技術(shù)，是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實(shí)現(xiàn)定量定性檢測(cè)的技術(shù)。Chen等利用該技術(shù)中的TaqMan方法同步同體系擴(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)熒光PCR快速檢測(cè)沙門氏菌。OPE公司也基于TaqMan原理推出沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，并被運(yùn)用于食物中毒調(diào)查，由于國(guó)外的沙門氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒的價(jià)格昂貴(每個(gè)樣品100元以上)，目前在國(guó)內(nèi)很少推廣。

4.3PCR-ELISA技術(shù)

該技術(shù)是將PCR技術(shù)與ELISA相結(jié)合的一種抗原檢測(cè)技術(shù)，又稱為免疫PCR。本質(zhì)是一種以PCR代替酶反應(yīng)來放大顯示抗原抗體結(jié)合率的改進(jìn)型ELISA。特點(diǎn)是利用PCR的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增效率帶來極高的敏感度。同時(shí)又具有高特異性的抗原檢測(cè)系統(tǒng)。原理是利用ELISA技術(shù)來檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，用生物素標(biāo)記寡核苷酸探針，以鏈霉親和素包被微孔反應(yīng)板，封閉后加入生物素標(biāo)記的探針與之結(jié)合，標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記探針進(jìn)行液相雜交，然后加入HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體，加入底物(TMP)顯色，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

鑒于我國(guó)國(guó)情，在生產(chǎn)中常用國(guó)標(biāo)法，有條件的單位應(yīng)用自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀、ELISA、PCR試劑盒檢測(cè)。

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