郭慶海

摘要在制備雛雞透明骨骼標(biāo)本的過程中，首先進(jìn)行材料的處理，然后用乙醇固定，氫氧化鉀透明，茜素乙醇飽和液染色，氫氧化鉀和甘油混合液褪色，甘油保存。最后制得的標(biāo)本生動(dòng)形象，易于對(duì)骨骼進(jìn)行原位觀察，立體感比較強(qiáng)，能從整體上顯現(xiàn)出骨骼系統(tǒng)在體內(nèi)的自然分布和位置，也能顯現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)骨骼系統(tǒng)的發(fā)育狀況，是較為理想的骨骼標(biāo)本制作方法。

關(guān)鍵詞雛雞標(biāo)本透明骨骼標(biāo)本固定標(biāo)本制作

中圖分類號(hào)Q-34文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B

透明骨骼標(biāo)本對(duì)于研究動(dòng)物的骨骼及其發(fā)育具有重要的參考價(jià)值，其可以顯示一般解剖方法難以觀察清楚的結(jié)構(gòu)，并在保持標(biāo)本外形完整的情況下顯示出體內(nèi)骨骼部分，從而顯示出生物體的骨骼發(fā)育情況，因而無論在教學(xué)方面還是科學(xué)研究方面都有其實(shí)際意義。

透明骨骼標(biāo)本的制作原理是應(yīng)用化學(xué)藥品和物理方法作用于肌體組織，使組織的折光率和透明劑的折光率相近，以達(dá)到透明的目的。小型動(dòng)物因骨骼纖細(xì)軟弱，且小型動(dòng)物的骨骼各個(gè)關(guān)節(jié)部位沒有完全骨化，制作單獨(dú)骨骼標(biāo)本很困難，而制作透明骨骼標(biāo)本解決了這些難點(diǎn)，且制作出來的透明標(biāo)本清晰美觀、有立體感，因此，一般小型的脊椎動(dòng)物都適合做透明骨骼標(biāo)本。

透明骨骼染色法簡(jiǎn)單，易于識(shí)別軟硬骨，成本低，國(guó)外廣泛使用，但在國(guó)內(nèi)則應(yīng)用較少，且由于傳統(tǒng)的透明骨骼標(biāo)本制作技術(shù)的透明過程復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)甚至幾個(gè)月，國(guó)內(nèi)研究較少。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到透明骨骼標(biāo)本在教學(xué)和科研中的重要作用，開始進(jìn)行透明骨骼標(biāo)本的制作，李錦和楊振坦等曾對(duì)動(dòng)物透明骨骼標(biāo)本做過一些研究，但仍存在一些不足。此外還有一些專家學(xué)者對(duì)鳥類以及動(dòng)物的胚胎進(jìn)行了研究，且傳統(tǒng)的透明骨骼標(biāo)本的制作多采用20日齡左右的鳥類，但剛出殼的雛雞從來沒有人做過透明骨骼標(biāo)本。

為此，本次實(shí)驗(yàn)選用1日齡的烏骨雞雛雞和3日齡的羅曼蛋雞雛雞作為實(shí)驗(yàn)材料，于2009年3-5月采用茜素乙醇飽和溶液進(jìn)行硬骨染色，使雛雞的全部骨骼在不受任何損傷的情況下清楚的展示出來，制作好的透明標(biāo)本其肌肉和軟組織結(jié)構(gòu)無色透明，而骨化中心和硬骨組織被染成紫紅色，界限清晰，易于識(shí)別，能提供傳統(tǒng)解剖方法不宜得到的信息?，F(xiàn)將具體方法及結(jié)果介紹如下。

1材料與方法

1，1供試材料

制作透明骨骼標(biāo)本的材料要求新鮮，最好是活體或剛剛死去的動(dòng)物尸體，不新鮮的組織透明效果不好，我們所選用的實(shí)驗(yàn)材料為1日齡的烏骨雞雛雞和3日齡的羅曼蛋雞雛雞，這些雛雞均購(gòu)置于徐州市果園種雞場(chǎng)，健康且發(fā)育良好。

1，2方法

1，2，1材料的處理

使雛雞窒息而亡，去皮和內(nèi)臟，去皮時(shí)應(yīng)先從腹下部提起皮膚，開一“+”型小口，分別向前向后撕去皮，腿部及爪部應(yīng)小心操作，去內(nèi)臟時(shí)從肛前開一小口從中掏出內(nèi)臟，且一定要去干凈，并注意保持形體完整。

1，2，2固定

將經(jīng)上述處理后的雛雞，綁在玻璃片上，整理好姿勢(shì)后浸在95％乙醇中固定5-7 d，使標(biāo)本有良好的形態(tài)，利于觀察研究。具體時(shí)間要根據(jù)動(dòng)物的體形大小而定，且要求在固定期間更換1～2次固定液，直至雛雞硬化固定充分為宜。

1，2，3透明

將固定好的雛雞標(biāo)本移入1％氫氧化鉀溶液中浸泡2-3 d，待肌肉半透明能隱約看到里面的骨骼時(shí)就要停止透明，如果浸制標(biāo)本沒有出現(xiàn)半透明，還要更換一次透明液，直至達(dá)到滿意效果為止。此步驟的目的是使標(biāo)本組織膨脹軟化，利于骨組織的染色。

1，2，4染色

將透明好的能隱約看到里面白色骨骼的標(biāo)本放人茜素紅乙醇染色液中進(jìn)行染色1－2 d，至肌肉成凍狀，并可看見骨組織染上紅色為止。茜素乙醇染色液的配制是：先將茜素紅染料溶于95％乙醇制成飽和溶液，然后用1份配好的茜素乙醇飽和液加9份70％乙醇。

1，2，5肌肉的褪色

將1％的氫氧化鉀溶液與5％的甘油溶液以1：1的比例配成混合液，將標(biāo)本浸泡在混合液中，時(shí)間為2-4 d，直至肌肉顏色褪為淡紅色為止。

1，2，6再透明

為了提高透明質(zhì)量，把標(biāo)本放人氫氧化氨甘油中(75mL水中加入20mL甘油和5mL氫氧化氨)進(jìn)行漂白透明。然后，再將標(biāo)本放入25％甘油中浸16 d左右，使標(biāo)本更加透明，再放入50％甘油中浸2-4 d，脫水，直到標(biāo)本肌肉完全透明為止。

1，2，7標(biāo)本的保存

將再透明好的標(biāo)本調(diào)整好姿態(tài)，使其趨于美觀，放人大小適宜的標(biāo)本瓶中，用100％甘油浸泡保存，并加入少許麝香草酚以防腐敗和發(fā)霉，瓶口用防水不干膠密封。

2結(jié)果與分析

此次實(shí)驗(yàn)選用了雛雞烏骨雞與羅曼蛋雞雛雞兩種材料，獲得了一套制作雛雞透明骨骼標(biāo)本的初步制作方法。制好的羅曼蛋雞透明骨骼標(biāo)本其肌肉和軟組織結(jié)構(gòu)無色透明，而骨化中心和硬骨組織被染成紅色，界限清晰，易于識(shí)別，能提供傳統(tǒng)解剖方法不宜得到的信息，顯示出雛雞體內(nèi)骨骼系統(tǒng)的自然分布和位置，立體感比較強(qiáng)。

但實(shí)驗(yàn)中對(duì)烏骨雞雖采用同樣的制作方法但效果并不好，可能是由于雛雞烏骨雞的肌肉等組織為黑色，不容易觀察標(biāo)本制作過程中的透明效果、褪色效果所致。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均是在室內(nèi)常溫下進(jìn)行的，且放置于向陽(yáng)處，保證溫度在20-30℃之間，因溫度高低可影響制作周期，溫度高可縮短制作周期，溫度低則相反，3、4、5三個(gè)月溫度剛好適宜。但制好的標(biāo)本不能讓陽(yáng)光直射，因?yàn)橥该魑镔|(zhì)在陽(yáng)光下會(huì)分解，出現(xiàn)渾濁，影響觀察標(biāo)本的效果。

制作好的雛雞透明骨骼標(biāo)本其肌肉組織無色透明，因?yàn)樽畛鯇?shí)驗(yàn)時(shí)就避免了影響標(biāo)本“無色透明”的因素，例如，雛雞選用活的即是新鮮的，去凈了皮和內(nèi)臟，因?yàn)楦瘮『陀傺牟牧蠒?huì)影響標(biāo)本的透明度；藥品力求純凈清潔，因?yàn)殡s質(zhì)可能使標(biāo)本染上雜色；水選用蒸餾水，因?yàn)樽詠硭杏须s質(zhì)不宜用于制作透明標(biāo)本。

3討論

此次實(shí)驗(yàn)是在不斷改進(jìn)中進(jìn)行的，即實(shí)驗(yàn)中因個(gè)別環(huán)節(jié)的失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效果不佳甚至失敗重做。如實(shí)驗(yàn)中一開始由于染色液配制的濃度較高，最后經(jīng)染色的標(biāo)本在褪色過程中，其肌肉的顏色很難褪去，只好重新開始再做。一般來說，選用低濃度長(zhǎng)時(shí)間的染色方法的染色效果比高濃度短時(shí)間較理想，染色時(shí)要經(jīng)常察看，掌握染色時(shí)間和染色程度，否則同樣容易產(chǎn)生染色過度，造成脫色困難。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，若標(biāo)本含有的脂肪組織較多，在固定后應(yīng)進(jìn)行脫脂操作，可選用丙酮或二甲苯脫脂3—7 d，這樣制作的標(biāo)本效果較好，若標(biāo)本含有的脂肪組織較少，可不需要進(jìn)行脫脂操作，因?yàn)楣潭ㄒ阂掖己屯该饕篕OH都具有一定的脫脂能力。

通常制作透明骨骼標(biāo)本的鳥類大多選用20日齡，實(shí)驗(yàn)時(shí)特意選用了1日齡和3日齡的雛雞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1日齡和3日齡的雛雞同樣可以做標(biāo)本。只是由于1日齡和3日齡的雛雞肌肉很薄嫩，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該隨時(shí)注意觀察，時(shí)間上要靈活掌握，尤其是透明這一步驟，適當(dāng)降低透明液KOH的濃度會(huì)更好，常用的濃度為2％，此時(shí)可用1％，不能為了加快速度而提高堿液濃度。另外實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要隨時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)肌肉稍透明，隱約可見骨骼就必須立即取出材料，更換溶液，否則時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)使骨架解離，肌肉腐蝕。因?yàn)闅溲趸浭菑?qiáng)堿，具有腐蝕性，可使組織膨脹軟化，堅(jiān)實(shí)性大為減低。

制作烏骨雞透明骨骼標(biāo)本的過程中，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)固定以及透明時(shí)間很有必要。實(shí)驗(yàn)中，透明之后烏骨雞就能通過肌肉看到里面的骨骼，后來又進(jìn)行了染色操作，這倒使得骨骼看不大清楚，因而由于烏骨雞骨骼為黑色可不進(jìn)行染色操作，只要能夠很好的透明，當(dāng)然若能夠去掉肌肉的顏色，效果會(huì)更好。至于如何把肌肉等組織帶有特殊顏色的小型脊椎動(dòng)物做成理想的透明骨骼標(biāo)本，還有待進(jìn)一步的探索研究。