吳 婧， 吳焱森， 趙長瑤 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠蛻膜組織TNF-α及NF-κB的表達(dá)

吳 婧， 吳焱森， 趙長瑤 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：比較正常妊娠與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠模型蛻膜組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)及核轉(zhuǎn)錄因子kppaB(NF-κB)的表達(dá)。方法：建立正常妊娠模型和LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型。采用SABC法測定兩組模型孕鼠13d蛻膜組織TNF-α和NF-κB的表達(dá)水平。結(jié)果：LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型蛻膜組織TNF-α和NF-κB的表達(dá)明顯高于正常妊娠模型(Plt;0.01)。結(jié)論：NF-κB異常表達(dá)可能是小鼠流產(chǎn)的重要因素。

蛻膜組織； 腫瘤壞死因子α(TNF-α)；核轉(zhuǎn)錄因子kppaB(NF-κB)；流產(chǎn)；小鼠

近年研究表明,不明原因的自然流產(chǎn)與母體腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)的表達(dá)水平升高有關(guān)[1,2]，TNF-α能直接引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胎盤出血。核轉(zhuǎn)錄因子kppaB(NF-κB)是一種快速反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，幾乎存在于所有細(xì)胞中，能調(diào)控許多趨化因子、粘附因子、生長因子等細(xì)胞因子(包括TNF-α)的生成，是基因發(fā)揮作用必須通過的基因開關(guān)[3，4]。蛻膜組織是母體與胎兒直接接觸的界面，蛻膜組織對胎兒的免疫耐受為維持妊娠所必需。本文通過比較正常妊娠與流產(chǎn)小鼠模型蛻膜組織TNF-α和NF-κB的表達(dá)水平，旨在探討二者在流產(chǎn)中的意義與作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 雌性(未經(jīng)產(chǎn))、雄性昆明小鼠各20只，10～12周齡，由長江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑與儀器 兔抗鼠NF-κB多克隆抗體、兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、即用型鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液(0.01mol/L，pH6.0)由武漢博士德公司提供。脂多糖(LPS)為美國Sigma公司產(chǎn)品。切片機(jī)(LEICA RM 2135，上海萊卡儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(Nikon eclipse E800, 日本Nikon)，顯微攝像系統(tǒng)(Spot Version3.5, Diagnostic instruments Inc, USA), 圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus Version 5.0.2，Media cyberntics Inc, USA)。

1.2方法

1.2.1建立小鼠模型及處理 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食飲水。日光照12h。經(jīng)適應(yīng)環(huán)境1周后，陰道涂片法進(jìn)行發(fā)情鑒定。發(fā)情母鼠與公鼠1∶1合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者定為孕0d。將受孕雌性小鼠隨機(jī)分為流產(chǎn)組和正常妊娠組，每組10只。流產(chǎn)組母鼠在孕7d尾靜脈注入LPS 0.1μg(0.2ml)。正常妊娠組母鼠注入磷酸緩沖液(PBS)0.2ml。于妊娠第13天處死孕鼠，取胎盤計(jì)算胚胎吸收率(R)以評價(jià)模型建立成功與否。R=[Re/(Re+F)]×100%，Re為吸收胚胎數(shù),F為存活胚胎數(shù)。吸收的胚胎個(gè)體小，顏色紫黑，出血壞死，有的已溶化為血團(tuán)塊；解剖鏡下觀察模糊一片，沒有胎膜結(jié)構(gòu)。存活胚胎個(gè)體較大，粉紅色；鏡下觀察胎膜及胎兒輪廓清晰，透光度好，無出血，淤血現(xiàn)象。

1.2.2標(biāo)本處理 在孕第13天處死兩組模型鼠，采集蛻膜組織(采集的組織均來自于吸收胚胎鄰近的正常存活胚胎)。將蛻膜組織用生理鹽水漂洗去掉血液后，用10 %中性甲醛固定24h，石蠟包埋,連續(xù)切片，每張厚約5μm。置60℃烤箱，72h烘干后備用。

1.2.3免疫組化SABC染色與觀察 按常規(guī)程序操作，TNF-α和NF-κB一抗工作液的濃度分別為1∶100和1∶100, DAB為顯色劑。用已知的TNF-α陽性SLCa切片和NF-κB陽性切片作陽性對照，用PBS代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。按陽性細(xì)胞所占的百分比分為4級：陰性(-)表現(xiàn)為不著色；弱陽性()表現(xiàn)為淺黃色；中度陽性()表現(xiàn)為深黃色；強(qiáng)陽性()表現(xiàn)為棕黃色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0系統(tǒng)軟件包，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組孕鼠的胚胎吸收率比較LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型孕鼠的胚胎吸收率明顯高于正常妊娠模型，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。見表1。

表1 兩組孕鼠胚胎吸收率比較

注：兩組間比較，*Plt;0.01。

2.2TNF-α的表達(dá)狀況TNF-α主要表達(dá)于正常子宮內(nèi)膜、流產(chǎn)子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞胞漿和胞膜。從表2可以看出，流產(chǎn)小鼠子宮內(nèi)膜比正常妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的TNF-α顯著升高。

2.3NF-κB的表達(dá)狀況NF-κB主要表達(dá)于正常子宮內(nèi)膜(見第92頁彩色圖版Ⅵ之圖1)、流產(chǎn)子宮內(nèi)膜(見第92頁彩色圖版Ⅵ之圖2)的蛻膜細(xì)胞胞漿，少數(shù)胞核中也有表達(dá)，在內(nèi)膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦有表達(dá)。從表3可以看出，流產(chǎn)小鼠子宮內(nèi)膜比正常妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的NF-κB顯著升高。

圖1 NF-κB在正常小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá) 圖2 NF-κB在流產(chǎn)小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)

表2 兩組母鼠子宮內(nèi)膜TNF-α的表達(dá)狀況 只

注：兩組間比較，*Plt;0.01。

表3 兩組母鼠子宮內(nèi)膜NF-κB的表達(dá) 只

注：兩組間比較，*Plt;0.01。

3 討 論

3.1TNF-α與流產(chǎn)的關(guān)系國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)率高的孕鼠胎盤中TNF-α表達(dá)顯著高于對照組，在蛻膜中有過量的TNF-α表達(dá)，且當(dāng)母胎界面TNF-α表達(dá)下降時(shí)孕鼠流產(chǎn)率也隨之下降[5，6]。妊娠期適量的TNF-α能促進(jìn)婦女能量代謝及胚胎發(fā)育，提高孕激素及絨毛膜促性腺激素的合成，并刺激細(xì)胞滋養(yǎng)層生成尿激酶型血漿素原激活劑(uPA)，有利于蛻膜細(xì)胞外基質(zhì)降解及胎盤植入，對妊娠維持有重要作用[7，8]。當(dāng)母體免疫功能異?；蚰承┮蛩厥咕奘杉?xì)胞等被激活，均可造成TNF-α水平升高，高濃度的TNF-α可能通過多種途徑導(dǎo)致流產(chǎn)：激發(fā)Th1型免疫反應(yīng)，排斥胚胎組織；促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡；提高前列腺素E2的合成，興奮子宮平滑肌引起宮縮；上調(diào)促凝血酶原激酶12(Fg12)表達(dá)，導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)層血管血栓形成，最終影響絨毛正常發(fā)育，出現(xiàn)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞(尤其是合體滋養(yǎng)細(xì)胞)凋亡增加，直接破壞胎盤屏障的完整性及功能，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[7，8]。本文結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型組孕鼠(胚胎吸收率25.81% )蛻膜組織TNF-α表達(dá)明顯高于正常妊娠模型組(胚胎吸收率8.75% )(Plt;0. 01)，這與國外的研究結(jié)果相符。

3.2NF-κB與流產(chǎn)的關(guān)系核轉(zhuǎn)錄因子kppaB是一種廣泛存在的多效性的核轉(zhuǎn)錄因子，為Rel蛋白家族成員，由多肽P50和P65亞基形成同源或異源性二聚體。在靜息細(xì)胞中，NF-κB主要位于細(xì)胞漿，與具有抑制作用的IкB家族結(jié)合，其錨蛋白重復(fù)序列掩蓋了NF-κB的DNA結(jié)合位點(diǎn)而干擾NF-κB的功能?？杀欢喾N刺激因子如脂多糖、TNF-a、IL-l、病毒、自由基及紫外線等激活，調(diào)節(jié)趨化因子、生長因子、粘附分子、免疫受體、應(yīng)激相關(guān)酶及急性期蛋白等[9-11]的功能。通過調(diào)控靶基因表達(dá)產(chǎn)物，NF-κB信號通道參與了感染、炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤等病程及細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞分化等[12，13]。研究表明NF-κB在多種炎癥疾病中均存在著活化現(xiàn)象[14]，調(diào)控眾多炎癥性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)[15]。NF-κB在激活后可使IL-l、TNF- mRNA的水平上調(diào)，而IL-l、TNF-a與流產(chǎn)的關(guān)系密切。本文結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型組孕鼠蛻膜組織NF-κB表達(dá)明顯高于正常妊娠模型組(Plt;0. 01)，表明NF-κB參與了流產(chǎn)過程?？赡苁荖F-κB引起炎性細(xì)胞增加，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞異常凋亡增加，子宮螺旋小動(dòng)脈急性粥樣硬化，胎盤出血、壞死增加等一系列病理反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)；NF-κB亦可通過增加TNF-a的表達(dá)而導(dǎo)致流產(chǎn)。有臨床研究證實(shí)，NF-κB在早期流產(chǎn)患者的絨毛組織中表達(dá)也增高[16]。

綜上所述，TNF-α及NF-κB參與了流產(chǎn)過程，但TNF-α及NF-κB對生殖過程各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)機(jī)理尚有待于進(jìn)一步研究。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.007

R392.11；R364.7

A

1673-1409(2009)04-R016-03

2009-07-31

吳婧(1980-)，女，湖北監(jiān)利人，講師，碩士，從事組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)與研究工作。