向光盛，余 露，陳 蓉 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 湖北 荊州 434023)

膠原蛋白的提純及體外聚合膠原纖維的三維特征分析

向光盛，余 露，陳 蓉 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 湖北 荊州 434023)

目的：探索一個簡要的膠原提純方法，比較提取不同來源的膠原蛋白的物理化學(xué)特性，利用影像法探討膠原纖維體外生長聚合三維構(gòu)建過程和特征，為生物醫(yī)學(xué)工程的生物材料設(shè)計和組織工程替代治療提供基礎(chǔ)。方法：利用乙酸法和酶的降解法提取豬腳關(guān)節(jié)韌帶、大鼠尾的膠原蛋白，用光學(xué)顯微鏡定量化分析纖維聚集動力學(xué)以及結(jié)構(gòu)特性，包括纖維密度、方向性融合。結(jié)果：組織和細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白單分子是120kD，Ⅰ型膠原α1(Ⅰ)以及α2鏈表達(dá)在120、116kD，Ⅰ型膠原蛋白基質(zhì)行成的膠原纖維狀。結(jié)論：應(yīng)用該修飾方法可提出并純化到純的膠原蛋白。第一次報道膠原基質(zhì)成分在體外可形成三維結(jié)構(gòu)并用黑白視野觀察纖維形成特征；陽離子鉀、鈉、溫度及pH影響纖維的強(qiáng)度和膠原的集結(jié)時間。

膠原蛋白；膠原纖維；聚合

下一代組織和器官恢復(fù)材料的發(fā)展需要較好的了解細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)是天然生物多聚物大分子的集合，包括膠原、粘多糖、蛋白聚糖以及糖蛋白[1]。有幾種細(xì)胞外基質(zhì)成分可形成三維結(jié)構(gòu)(支架結(jié)構(gòu))。在體外這種超分子基質(zhì)形成通過自我定向聚合作用“自我裝配”[2]。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)主要結(jié)構(gòu)成份，Ⅰ型膠原分子通常由α1鏈和α2鏈組成，多細(xì)胞動物的進(jìn)化過程和發(fā)育依賴于這種蛋白能夠自我集合成很長多聚體，最長和最豐富是Ⅰ型膠原含有D-型周期纖維，這種纖維出現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)像肌腱和韌帶，Ⅰ型膠原是三螺旋結(jié)構(gòu)蛋白，具有自我集合成纖維狀，這種纖維長度可達(dá)數(shù)百微米長，更甚者達(dá)數(shù)厘米長。膠原可從組織中提取，純化并在體外再重構(gòu)建產(chǎn)生D-周期纖維。同樣，體外形成的纖維也可在有N-端和C-端蛋白酶存在下分解成前體膠原。然而由于體內(nèi)集合過程更復(fù)雜，并產(chǎn)生方向一致很長的膠原纖維，詳盡懂得這一形成的分子機(jī)理仍相當(dāng)困難。我們第一次用黑白顯微鏡觀察個別膠原纖維在體外的生長，監(jiān)測纖維產(chǎn)生的改變，直接研究膠原纖維形成及影響多聚體過程分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1材料大鼠尾、豬腳的關(guān)節(jié)韌帶，乙酸，聚丙酰胺凝膠，蛋白膠原酶懸，考馬斯蘭。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型膠原蛋白的分離與純化 通過用Chandrakasa,Torchia and piez(1976)的方法并作適當(dāng)修改[3，4]，將韌帶纖維分離，準(zhǔn)備提取可溶膠原。簡單地將腱和韌帶從大鼠尾的肌層下解剖剝離，切成小塊，去除蛋白聚糖，離心，然后將小塊組織再放入Tris-Hc1緩沖溶液中，4℃攪拌過夜，這一過程導(dǎo)致組織分散，這種分散像溶液中含有自然膠原，膠原纖維片段懸液離心40min以上(10 000g)，收集懸液；剩余組織再在20倍體積的0.5M乙酸過夜攪拌，在10 000g再離心40min收集懸液；兩次懸液再加3%氯化鈉沉淀，離心，放入0.1M乙酸含有胃蛋白酶的溶液中攪拌過夜，上清懸液含有胃蛋白酶化的膠原，加3%Na2HPO4停止酶的反應(yīng)，并在1mM乙酸中透析，透析后的粘稠液體通過超速離心，膠原蛋白以液體方式存-20℃保存(或冷凍干燥成固體)。純化的膠原蛋白在6% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳下通過測定其分子量表達(dá)并證明其純化的純度。

1.2.2膠原纖維形成過程 膠原在體外誘導(dǎo)生長聚集成纖維，利用已分離純化的膠原溶解到乙酸并旋轉(zhuǎn)2～3h，加適當(dāng)陽離子調(diào)pH至7，滴少許在載玻片上放30～37℃培養(yǎng)，并在不同時間在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)。有條件可用聚焦控溫顯微鏡下連續(xù)觀察，并自動記錄其生長自我聚集過程。

2 結(jié) 果

圖1 6% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示了提取純化的膠原蛋白表達(dá)特征；顯示了Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈和α2鏈表達(dá)。欄1代表鼠尾膠原蛋白，欄2和3代表豬韌帶膠原蛋白，攔4和5代表豬皮膠原蛋白，欄6購買商品牛皮Ⅰ型膠原蛋白參考對照。

2.1證明膠原蛋白提取的方法的可行性和膠原蛋白的純度為了證明提取的膠原蛋白的方法的可行性，將純化的膠原蛋白在6% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯蘭染色，我們的結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原α1(Ⅰ)以及α2鏈表達(dá)在120、116kD，α鏈二聚體及三聚體在220、270kD，模糊60kD可能代表蛋白聚糖。為了探查其敏感性，我們用膠原酶消化Ⅰ型蛋白膠原，當(dāng)用膠原酶消化后，所有帶都消失，證明分離純化的產(chǎn)品全是膠原蛋白(見圖1)。為了探查膠原蛋白在組織結(jié)構(gòu)中的分布的組織差異性，我們選擇三種組織(大鼠尾、豬腳的關(guān)節(jié)韌帶及豬皮)分別提純比較，組織和細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白單分子是120kD。

2.2膠原基質(zhì)纖維自我聚合及再構(gòu)建的三維特征和顯微鏡量化分析我們用光學(xué)顯微鏡量化纖維聚集動力學(xué)以及結(jié)構(gòu)特性，包括纖維密度、方向性融合。結(jié)果中可以觀察至膠原纖維融合形成單極或雙極頂端融合(見第89頁彩色圖版Ⅱ之圖2A箭頭)。纖維形成像繩索或捆綁(見第89頁彩色圖版Ⅱ之圖2 B、C)。黑白視野顯微鏡觀察到了膠原基質(zhì)纖維自我聚合的再構(gòu)建的三維特征(見第89頁彩色圖版Ⅱ之圖3)。我們可觀察到膠原纖維成分以及它們的空間分布。

圖2 光學(xué)顯微鏡(Axiosko 2 )證明I型膠原蛋白基質(zhì)行成的膠原纖維差異。 纖維形成像繩索或捆綁或(A、B、C)以纖維尖對纖維尖融合。

圖3 膠原基質(zhì)纖維自我聚合及再構(gòu)建的三維特征

3 討 論

膠原分子是一高度不對稱的兩性聚電解質(zhì)，具有很強(qiáng)的溶解反應(yīng)[5，6]。這些反應(yīng)是對pH、離子強(qiáng)度、溫度以及膠原濃度的反映。這種分子之間的反應(yīng)是導(dǎo)致聚集的形式，最終可能形成自然膠原纖維。在聚集過程中，目前大多數(shù)穩(wěn)定地可溶性膠原交聯(lián)成寡單聚體，這種寡單聚體可從父代組織中直接提取，為了探查膠原蛋白在組織結(jié)構(gòu)中的分布組織差異性，我們選擇三種組織(大鼠尾、豬腳的關(guān)節(jié)韌帶及豬皮)分別提純比較，組織和細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白單分子是120kD，我們的結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原α1(Ⅰ)以及α2鏈表達(dá)在120及116kD，α鏈二聚體及三聚體在220和270kD，模糊60kD可能代表蛋白聚糖。為了探查其敏感性，我們用膠原酶消化Ⅰ型蛋白膠原，當(dāng)用膠原酶消化后，所有帶都消失，證明分離純化的產(chǎn)品全是膠原蛋白。

用光學(xué)顯微鏡量化纖維聚集動力學(xué)以及結(jié)構(gòu)特性，包括纖維密度、方向性融合。結(jié)果中可以觀察至纖維融合形成單極或雙極頂端融合。綜合分析，這些技術(shù)證明了纖維融合的差異性、三維結(jié)構(gòu)及集合特性。之前用掃描電子顯微鏡觀察到的結(jié)構(gòu)也可在體外聚合，證明其是依賴的基質(zhì)成份[7]。這種體外的聚合隨膠原濃度的增加纖維密度增加。但我們不能測量其纖維的直徑和強(qiáng)度。

我們利用乙酸法和酶的降解法提取的膠原蛋白，通過聚乙酰胺凝膠電泳揭示了其分子量及純度，結(jié)果顯示其分子量約120kD并評估Ⅰ型和Ⅱ膠原蛋白的比率，利用黑白視野顯微鏡，監(jiān)測了膠原纖維生長，形狀及聚合過程，陽離子鉀、鈉、溫度及pH影響纖維的強(qiáng)度和膠原的集結(jié)時間。下一步我們將在有條件的情況下，應(yīng)用聚焦顯微鏡研究其三維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間的反應(yīng)，為生物組織工程奠定基礎(chǔ)。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.003

R33

A

1673-1409(2009)04-R006-02

2009-11-20

向光盛(1957-)，男，湖北荊州人，教授，從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)的教學(xué)與研究工作。