劉 洋

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

曾昭淳

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

劉 洋

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

曾昭淳

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

目的：克隆人F3-Restin基因，表達(dá)有生物學(xué)活性的新型融合蛋白F3-Restin。方法：采用亞克隆技術(shù)構(gòu)建融合表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin，原核誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Ni2+-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂親和層析純化，透析去鹽。結(jié)果：在20℃、10h的條件下IPTG原核誘導(dǎo)表達(dá)、純化，得到分子量約為40kD的高純度的可溶性蛋白F3-Restin。結(jié)論：成功地克隆了人F3-Restin基因，構(gòu)建融合表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin，并表達(dá)出新型融合蛋白F3-Restin，為進(jìn)一步研究F3-Restin蛋白抗腫瘤血管生長(zhǎng)的活性及作用機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ)。

F3-Restin基因；克??；表達(dá)；純化

腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散依賴血管生成，抑制新血管的生成是抑制腫瘤生長(zhǎng)的有效途徑。利用高選擇性抑制腫瘤血管增生的藥物，對(duì)于提高抗腫瘤藥物的治療效果，降低藥物的用量，尤其顯著降低藥物毒性和副作用具有重要意義。

F3肽是人類(lèi)高遷移蛋白2(Human high mobility group protein-2, HMGN-2)N-末端的31個(gè)氨基酸的片段[1]。F3肽段幾乎能與所有被測(cè)試的腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞高選擇性地結(jié)合，可以將噬菌體和熒光染料帶到腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞[1]。因此，F(xiàn)3是針對(duì)腫瘤組織靶向給藥的優(yōu)良載體，能夠攜帶抗腫瘤血管的肽類(lèi)、藥物實(shí)現(xiàn)靶向給藥。Restin[2]是1999年新發(fā)現(xiàn)的新生血管抑制因子，為XVⅢ膠原的C末斷片段，分子量為20kD，它可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及由VEGF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在動(dòng)物腎癌模型中抑制腫瘤的形成。人體血液中有天然Restin存在[3]，它與XVⅢ膠原的C末斷片段內(nèi)皮抑素氨基酸序列有61%的同源性，也具有抑制血管發(fā)生的功能。

本實(shí)驗(yàn)采用亞克隆技術(shù)從重組克隆載體pEKH-F3獲得F3基因，與PET32a(+)-Restin構(gòu)建融合表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin，原核表達(dá)、純化，為進(jìn)一步研究F3-Restin的功能及機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株重組克隆載體pEKH-F3和大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存，PET32a(+)-Restin由重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.2引物及主要試劑根據(jù)F3肽基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，逆向引物加6個(gè)甘氨酸作柔性連接于restin的N端。

P1：5’-GAGGATCCAAAGATGAACCGCAACGTCGTAG-3’，

P2：5’-CGAAGCTTACCACCACCACCACCACCCTTCTTAGCCGGTGCTTTT-3’。

分別加有BamHⅠ與HindⅢ的酶切位點(diǎn)，由北京賽百盛生物公司合成。TaqDNA聚合酶、內(nèi)切酶BamHⅠ與HindⅢ購(gòu)自Takara公司；T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；DNA片段回收采用上海華舜公司膠回收kit;His-Tag融合蛋白純化試劑盒購(gòu)自Merk公司。其他主要試劑為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3F3基因片段的擴(kuò)增、PET32a(+)-F3-Restin表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序以pEKH-F3質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增F3基因片段，PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3min后，94℃變性30s,62℃退火30s,71℃延伸30s,30次循環(huán)，最后71℃保溫7min，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，F(xiàn)3基因片段及重組克隆載體PET32a

(+)-Restin分別BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，凝膠電泳回收，用T4連接酶4℃連接過(guò)夜，構(gòu)建載體PET32a(+)-F3-Restin，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，LA平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆，培養(yǎng)、提質(zhì)粒，雙酶切鑒定后，送上海生工所測(cè)序確認(rèn)。

1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為PCR產(chǎn)物。圖1 F3基因PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1.4F3-Restin表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定將PET32a(+)-F3-Restin轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽(yáng)性克隆于LA培養(yǎng)基中，當(dāng)OD590=0.7～0.9時(shí)，加入IPTG至1.0mmol/L,于20℃繼續(xù)培養(yǎng)12h后收集菌體。菌體經(jīng)冰浴超聲破菌后離心，分別取上清和沉渣，12%的SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，用薄層掃描儀計(jì)算F3-Restin在菌體總蛋白中的含量。

1.5F3-Restin表達(dá)產(chǎn)物的純化菌體超聲破菌后，取上清，用Ni2+-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂進(jìn)行純化。參照Novagen公司的His.Bind Kits說(shuō)明進(jìn)行純化，12%的SDS-PAGE分析純度及酶切產(chǎn)物，透析去鹽，Bradford法對(duì)純化的蛋白定量。

2 結(jié)果

1,2為BamHⅠ/EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒PET32a(+)-F3-Restin；3為未酶切的重組質(zhì)粒PET32a(+)-F3-Restin。圖2 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

2.1F3基因片段的擴(kuò)增、PET32a(+)-F3-Restin表達(dá)載體的構(gòu)建及序列鑒定以pEKH-F3質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)約140bp的F3基因片段(見(jiàn)圖1)，回收目的片段，F(xiàn)3基因片段及重組克隆載體PET32a(+)-Restin分別BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，凝膠電泳回收，用T4連接酶4℃連接過(guò)夜，構(gòu)建表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin，經(jīng)PCR及BamHⅠ/EcoRⅠ酶切片段大小確認(rèn),F3-Restin基因片段長(zhǎng)約700bp(見(jiàn)圖2)，測(cè)序表明讀碼框正確，表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

1為蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)(14.4、20.0、28.5、35.0、45.0、66.2、94.0kD)；2為未加IPTG誘導(dǎo)；3為IPTG、37℃誘導(dǎo)4h；4為IPTG、37℃誘導(dǎo)3h；5為IPTG、37℃誘導(dǎo)2h；6為IPTG、20℃誘導(dǎo)10h圖3 F3-Restin在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

2.2F3-Restin表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化用1.0mmol/L的IPTG分別于37℃下2、3、4、5、6h和20℃、10h誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)，與未誘導(dǎo)的比較，發(fā)現(xiàn)37℃、4h和20℃、10h在12%的SDS-PAGE上約40KD處均有一明顯的表達(dá)條帶，Quantity One軟件分析，表達(dá)量占菌體總蛋白含量的35%。菌體裂解后的SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物絕大部分以可溶性的存在，且在20℃、10h的條件下最優(yōu)(見(jiàn)圖3)。經(jīng)Ni2+-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂親和層析純化，透析去鹽，得到分子量約為40kD的高純度的蛋白(見(jiàn)圖4)。

3 討論

1、為蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)(14.4、20.0、28.5、35.0、45.0、 66.2、94.0KD)；2、3、4、5為鎳柱純化不同時(shí)間的洗脫物。圖4 F3-Restin經(jīng)Ni2+-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂純化結(jié)果(20℃、10h)

血管生成抑制肽通過(guò)抑制腫瘤新血管的生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前已經(jīng)報(bào)道的血管生成抑制肽有很多，包括血管抑素angiostatin[4]、內(nèi)皮抑素endostatin[5]、Tumstatin (IV型膠原α3鏈非膠原區(qū)片段)[6]、Canstatin (IV型膠原α2鏈片段)[7]、Restin (膠原ⅩⅤ片段)[2]等。如何讓這些藥物準(zhǔn)確的、選擇性的作用于腫瘤新生血管，減少藥物的用量，降低藥物的毒副作用，提高藥物的臨床抗腫瘤治療效果是目前開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物的難題，也具有非常重要的醫(yī)學(xué)實(shí)踐意義?；诖?，我們采用F3與Restin基因連接構(gòu)建了新的表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin，擬研究出新的具有導(dǎo)向腫瘤新生血管及抗癌活性的融合蛋白。

本文采用亞克隆的方法，構(gòu)建了新的表達(dá)載體PET32a(+)-F3-Restin,并用LA培養(yǎng)基于20℃、10h，以1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)出可溶性的蛋白產(chǎn)物，純化出具有生物學(xué)活性的蛋白，解決了原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因常常為不溶性包涵體的難題。我們能夠得到可溶性的重組融合蛋白主要有以下幾個(gè)方面的原因：①與硫氧還蛋白(Trx)融合表達(dá)，許多蛋白要求形成穩(wěn)定的二硫鍵才能形成天然空間結(jié)構(gòu)，沒(méi)有二硫鍵，這些蛋白可能被降解或者會(huì)形成包涵體，而硫氧還蛋白(Trx)能催化二硫鍵的形成，且本身溶解性能極高；②37℃生長(zhǎng)常常會(huì)使一些蛋白累計(jì)形成包涵體，而較低溫度生長(zhǎng)可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。如果打算利用一些PET載體中的信號(hào)肽序列輸出蛋白的話，在25℃或30℃培養(yǎng)可能是最優(yōu)化的。在某些情況下，低溫(15～20℃)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間(過(guò)夜)可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最大；③裂解緩沖液的性質(zhì)會(huì)大大影響到目的蛋白可溶與不溶形式之間的比例。當(dāng)采用一般的裂解緩沖液如1×His Binding Buffer(包括500mmol/L氯化鈉)時(shí)，一些包含疏水或膜相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白可能會(huì)歸于不溶，但并不出現(xiàn)在包涵體中。在裂解緩沖液中加入毫摩爾的非離子型或雙性去污劑可以將由于與細(xì)菌脂或膜結(jié)合而不溶的蛋白組分轉(zhuǎn)變成可溶組分。

實(shí)驗(yàn)中，我們采用了6個(gè)甘氨酸的柔性片段連接F3肽和Restin，保證了重組后的融合肽兩個(gè)肽片段保持各自的正確空間構(gòu)象和生物學(xué)活性。F3肽對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的高選擇性及內(nèi)化作用[1]，為血管生成抑制肽Restin[2]提供了優(yōu)良的靶向載體，我們期待Restin蛋白在F3肽的引導(dǎo)下，靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞并內(nèi)化，發(fā)揮其良好的抗腫瘤血管發(fā)生的作用。所以，新型融合蛋白F3-Restin基因的克隆及可溶性目的蛋白的成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究此種新型融合肽的靶向腫瘤新生血管和抗腫瘤血管生長(zhǎng)的活性及作用機(jī)理作好了物質(zhì)準(zhǔn)備，有望成為更安全、更有效的抗腫瘤生物制劑。

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[編輯] 一 凡

2009-05-19

劉洋(1979-)，男，湖北潛江人，講師，碩士，從事腫瘤生化與分子生物學(xué)教學(xué)與研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.03.005

R34

A

1673-1409(2009)03-R011-03