楊小琴 李善才 李增偉 胡曉燕 孫利軍

摘要綜述了近幾年來(lái)馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)的研究進(jìn)展,從馬鈴薯生產(chǎn)概況及危害馬鈴薯的主要因素、莖尖剝離發(fā)展歷史及原理、莖尖脫毒技術(shù)要點(diǎn)、影響馬鈴薯莖尖脫毒效率的因素方面作了概述并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望,以為馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞馬鈴薯;莖尖;脫毒;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)S532文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)22-0085-02

ReasarchReviewOn Virus-freeTechnology ofPotatoStep-tip Tissue Culture

YANG Xiao-qinLI Shan-caiLI Zeng-weiHU Xiao-yanSUN Li-jun

(Yulin Institution of Agricultural Sciences,Yulin Shaanxi 719000)

AbstractIn the paper,the recent studies on step-tip tissue culture of potato were reviewed. The respects about potato production situation,factors of potato production,historical development, theory and outline of virus-free on step-tip,and influencing factors on virus-free on step-tip tissue culture were summaried.Then the development prospect was presented so as to lay a foundation for the development of potato step-tip virus-free tissue culture.

Key wordspotato;step-tip;virus-free;tissue culture

馬鈴薯栽培分布較廣,世界上共有148個(gè)國(guó)家栽培,主要分布在歐洲和亞洲。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織資料統(tǒng)計(jì),全世界現(xiàn)有馬鈴薯栽培面積為1 838.1萬(wàn)hm2,總產(chǎn)量29 511.8萬(wàn)t,平均單產(chǎn)16t/hm2[1,2]。我國(guó)是馬鈴薯種植大國(guó),種植總面積逾460萬(wàn)hm2,是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)[3,4]。預(yù)計(jì)到2010年,我國(guó)馬鈴薯種植面積將達(dá)到600萬(wàn)hm2,屆時(shí)我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量將達(dá)到1.8億t。近年來(lái),隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和種薯、商品薯、加工企業(yè)市場(chǎng)的發(fā)展,優(yōu)質(zhì)馬鈴薯加工產(chǎn)品供不應(yīng)求,加工用薯比例大幅度增加,馬鈴薯栽培正成為種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收的一項(xiàng)戰(zhàn)略選擇,而馬鈴薯種植逐步走向規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化、區(qū)域化[5]。

但在馬鈴薯連年的栽培過(guò)程中,由于病毒或類病毒的侵染和積累,造成馬鈴薯質(zhì)量退化和產(chǎn)量下降,因而栽培無(wú)病毒植株具有重要的生產(chǎn)價(jià)值。解決馬鈴薯退化,獲得無(wú)病毒植株的途徑有自然選擇、物理學(xué)方法、化學(xué)藥劑處理、生物學(xué)方法等。其中最行之有效的方法便是生物學(xué)方法中的莖尖脫毒。該文就馬鈴薯的莖尖脫毒及影響其脫毒效果的技術(shù)措施進(jìn)行了綜述,以期為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)脫毒苗,保證種薯源頭質(zhì)量提供參考。

1馬鈴薯產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及危害其生產(chǎn)的主要因素

栽培種的馬鈴薯(Solanum tuberosum L.,2n=48)是雙子葉種子植物,屬茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)一年生喜涼草本植物[6]。又名洋芋、土豆,原產(chǎn)南美洲,在我國(guó)已有300多年的栽培歷史。馬鈴薯生育期短,產(chǎn)量高,營(yíng)養(yǎng)豐富,是典型的糧菜兩用型作物,是我國(guó)四大栽培作物之一。

世界馬鈴薯面積分布的最大特點(diǎn)是以歐、亞兩洲種植為主,兩者種植面積占世界馬鈴薯總面積的78%,其中中國(guó)、俄羅斯、烏克蘭、印度四大生產(chǎn)國(guó)占世界種植面積的1/2[7]。而馬鈴薯的發(fā)源地南美洲種植面積只占世界馬鈴薯總面積的5%。除整個(gè)美洲大陸保持相對(duì)穩(wěn)定外,歐洲的種植面積在持續(xù)減少,而亞洲、非洲的種植面積在不斷增加。馬鈴薯在生產(chǎn)上絕大多數(shù)是利用塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖[4]。國(guó)際馬鈴薯中心(CIP)和國(guó)際食品政策中心(IFPRI)合作研究表明,到2020年為止,全世界對(duì)馬鈴薯的需求將有望增長(zhǎng)40%,超過(guò)水稻、小麥和玉米的增長(zhǎng)。特別是亞洲和非洲對(duì)馬鈴薯的需求將增長(zhǎng)更快[8]。

馬鈴薯在栽培過(guò)程中,植株逐年變小,葉片皺縮卷曲,葉色濃淡不均,莖桿矮小細(xì)弱,塊莖變形龜裂,產(chǎn)量逐年下降,這些都表明馬鈴薯已經(jīng)發(fā)生退化。種薯退化是引起產(chǎn)量降低和商品性狀變差的主要原因[9]。據(jù)此,科學(xué)家從植物生理學(xué)、生物化學(xué)、栽培技術(shù)、栽培環(huán)境、種薯貯藏條件、病蟲害侵染等方面對(duì)馬鈴薯“退化”進(jìn)行了深入的研究,研究表明,各種病毒、真菌、細(xì)菌等對(duì)馬鈴薯的侵染是導(dǎo)致我國(guó)馬鈴薯單產(chǎn)較低的主要原因[10-12]。

目前,已知的馬鈴薯侵染病毒約有30種,由于馬鈴薯育種體系尚不健全,農(nóng)民自留種現(xiàn)象普遍,致使病毒感染面積占到栽培總面積的80%以上。在我國(guó)廣大馬鈴薯產(chǎn)區(qū),危害馬鈴薯的5種主要病毒為馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯A病毒和Y病毒(PVA,PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV),以及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)。其中PVY、PLRV是危害最為嚴(yán)重的2類病毒。

2莖尖脫毒技術(shù)發(fā)展歷史及其原理

馬鈴薯莖尖培養(yǎng)(stem/shoot tip culture),又叫分生組織培養(yǎng)(meristem culture),是包括馬鈴薯在內(nèi)的許多植物脫除病毒的重要手段。

1943年,P.R White將系統(tǒng)感染了奧古巴花葉病毒的番茄根(長(zhǎng)120mm)等分為12段,分別接種到心葉煙上,36h后,接種近生長(zhǎng)點(diǎn)的2段在心葉煙上未產(chǎn)生病斑,而接種在遠(yuǎn)生長(zhǎng)點(diǎn)的10個(gè)切段均出現(xiàn)病斑,且離生長(zhǎng)點(diǎn)愈遠(yuǎn)病斑愈多。B.Kassanis(1957)、Crowley & Hanson(1960)等進(jìn)一步證明,細(xì)胞分裂與病毒復(fù)制之間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,在活躍的莖尖分生組織中,正常核蛋白合成占優(yōu)勢(shì),病毒粒子得不到復(fù)制的營(yíng)養(yǎng)而受到抑制[13]。

1955年,法國(guó)人G.Morel和C.Martin通過(guò)莖尖培養(yǎng),獲得了無(wú)PVX、PVA和PVY的馬鈴薯植株,此后,這項(xiàng)技術(shù)快速發(fā)展,為解決馬鈴薯病毒危害提供了有效途徑。目前,世界上幾乎所有的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)都采用這一技術(shù)。

我國(guó)在20世紀(jì)70年代初由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、遼寧省農(nóng)科院和黑龍江省克山農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所對(duì)莖尖組織培養(yǎng)進(jìn)行了初步試驗(yàn),自1974年開(kāi)始,中國(guó)科學(xué)院植物研究所、微生物研究所、動(dòng)物研究所、黑龍江省克山農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、內(nèi)蒙古烏蘭察布盟農(nóng)科所以及內(nèi)蒙古大學(xué)等單位協(xié)作,開(kāi)展了莖尖組織無(wú)病種薯的技術(shù)和應(yīng)用研究,1976年內(nèi)蒙古建立了我國(guó)第1個(gè)馬鈴薯脫毒原種場(chǎng),從而開(kāi)始了我國(guó)無(wú)病毒種薯的生產(chǎn)時(shí)代[4]。

莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植物體內(nèi)分布的不均勻性,即根尖和芽尖的分生組織含病毒量少或不含病毒進(jìn)行培養(yǎng)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因至今還未明確,主要包括:①病毒的復(fù)制須利用寄主的代謝過(guò)程,無(wú)法與分生組織旺盛的代謝活動(dòng)競(jìng)爭(zhēng);②分生組織缺乏真正的維管組織,大多數(shù)病毒在植株內(nèi)通過(guò)韌皮部進(jìn)行遷移,或在細(xì)胞間通過(guò)胞間連絲傳輸[14]。病毒在細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)速度較慢,在快速分裂的組織中病毒濃度高峰被推遲[15-17];③分生組織的生長(zhǎng)素濃度通常很高,可能影響病毒的復(fù)制。也有一些病毒如PVX,在人們所有觀察的分生組織中都有存在,但通過(guò)莖尖培養(yǎng)依然可以脫去PVX,這說(shuō)明PVX在培養(yǎng)過(guò)程中是可以被脫去的,其機(jī)制可能是分離組織所產(chǎn)生的某種鈍化因子或培養(yǎng)基中某種成分對(duì)病毒的效應(yīng)所致,也可能是分離組織與培養(yǎng)基接觸的結(jié)果。病毒復(fù)制時(shí),需要某些作用于靠近分生組織圓錐體細(xì)胞的酶類,當(dāng)莖尖被剝成很小時(shí),它們的生長(zhǎng)過(guò)程暫時(shí)被打亂了,病毒復(fù)制時(shí)所需要的酶失去作用,從而中斷了傳染性病毒的復(fù)制[18]。一般認(rèn)為,類病毒是無(wú)法脫除的,但經(jīng)過(guò)重復(fù)莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理也可脫去PSTVd,只是脫毒率太低,具體機(jī)制尚待研究[19]。

3馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)

馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)屬植物組織培養(yǎng)中的體細(xì)胞培養(yǎng)[20],莖尖脫毒是多數(shù)植物汰除病毒病的方法,其主要技術(shù)步驟如下[21,22]:首先將帶毒薯在室內(nèi)催芽、消毒處理;然后在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下,切取0.1~0.3mm、帶1~2個(gè)葉原基的莖尖分生組織,移植于裝有MS培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng),大約4個(gè)月后,莖尖分生組織長(zhǎng)成試管苗;試管苗經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè),從大量植株中鑒定出確實(shí)不帶病毒的脫毒苗;再經(jīng)過(guò)切段快繁、脫毒微型薯(原原種)的誘導(dǎo),原種、良種繁育,直至大田生產(chǎn)商品薯[4,23,24]。將莖尖脫毒技術(shù)和高效留種技術(shù)相結(jié)合,并建立科學(xué)合理的良種繁育體系,是大幅度提高馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量的可靠保證。

馬鈴薯在脫毒過(guò)程中去除了主要病毒,恢復(fù)了原品種的特征特性,達(dá)到了復(fù)壯的目的。同時(shí)也將其所感染的真菌和細(xì)菌病原物一并脫除,而且脫毒薯在一定時(shí)期內(nèi),沒(méi)有病毒、細(xì)菌和真菌病害,其生活力特別旺盛。

4影響馬鈴薯莖尖脫毒效率的因素

4.1莖尖大小和病毒種類

病毒濃度在莖尖附近呈遞減分布,因此莖尖越小脫毒效果越理想,但莖尖就越難成活。此外,不同病毒在莖尖分布不同。一般來(lái)說(shuō),各種病毒的脫除從易到難順序?yàn)?PLRV>PVA>PVY>馬鈴薯奧古巴花葉病毒(PAMV)>PVM>PVX>PXS>PSTVd。但此順序也會(huì)因品種、培養(yǎng)條件、病毒株系不同等而有所變化[25-28]。

4.2化學(xué)制劑

化學(xué)治療劑能提高培養(yǎng)基去除病毒的能力。如在培養(yǎng)基中加入堿性孔雀綠、2,4-D和硫尿嘧啶等病毒抑制劑,能顯著提高無(wú)病毒植株的數(shù)量。一些研究學(xué)者在甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒研究中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加適量的TS制劑(一種病毒鈍化劑)雖稍微抑制了莖尖的發(fā)育,但可以提高脫毒率,但TS制劑對(duì)馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒是否有相同的效果,仍值得研究和探討[29]。

4.3高溫處理

為提高脫毒效果,莖尖培養(yǎng)還可與熱處理結(jié)合使用,其方法是脫毒植株長(zhǎng)到3cm左右時(shí),進(jìn)行變溫處理(白天37℃處理12h,晚上25℃處理12h)4周。在一定的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行熱處理,寄主組織很少受傷害甚至不受傷害,而植物組織中很多病毒卻可被部分地或完全鈍化。如高溫預(yù)處理可以顯著提高對(duì)PAMV、PVX和PVS的去除[30,31]。

4.4影響病毒去除的其他因素

去除病毒的難易還受其他病毒的干擾:只有PVX存在時(shí),從莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的42株植物中,有34株是無(wú)這種病毒的;但當(dāng)植物受PVX病毒及其他病毒復(fù)合侵染時(shí),從莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的34株植物中只有2株是無(wú)PVX病毒的,這說(shuō)明病毒之間存在著干擾作用[27]。此外,病毒去除還與培養(yǎng)條件有密切的關(guān)系。通常,接種的莖尖放在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng),溫度可在15~30℃范圍內(nèi),以20℃為宜,光照1 000~3 000Lx,以日光燈為光源,每天照光16h。

5展望

馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒是目前脫除病毒最常用、效果最好的方法,在脫毒過(guò)程中,影響莖尖成活、成苗及脫毒效率的因素諸多,尤其是莖尖培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基中所加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的絕對(duì)濃度和配比及培養(yǎng)基的狀態(tài)等研究上存在著較大分歧。脫毒技術(shù)體系中,有關(guān)熱處理的方法、莖尖的大小及病毒脫除的難易程度等均有不同的說(shuō)法和做法。因此,對(duì)影響莖尖成活、成苗及脫毒過(guò)程中的諸多影響因素進(jìn)行比較、系統(tǒng)地研究,具有一定的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義,它可以為馬鈴薯脫毒技術(shù)人員提供一條切實(shí)可行、高效率的脫毒途徑。

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