李　丹　喬　群　王曉軍　錢建平

[摘要]目的:比較重組腺病毒、慢病毒載體介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的人脂肪來(lái)源干細(xì)胞(hADSCs)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和外源基因表達(dá)差異。方法:原代分離培養(yǎng)hADSCs并鑒定，應(yīng)用Ad5F35-EGFP及LV-EGFP以MOI=0、25、50、100、200、400、800 感染hADSCs，在1、3、7、14、21天應(yīng)用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)表達(dá)EGFP細(xì)胞陽(yáng)性率。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)hADSCs增殖的影響。Von Kossa染色、油紅O染色檢測(cè)體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)EGFP的hADSCs向成骨及成脂方向分化能力。結(jié)果:hADSCs細(xì)胞表面標(biāo)記CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR陰性，CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166陽(yáng)性。熒光顯微鏡觀察Ad5F35-EGFP 感染hADSCs后（1～7天）可見(jiàn)EGFP高表達(dá)，此后逐漸減弱；LV-EGFP感染hADSCs后21天，仍可見(jiàn)EGFP高表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad5F35-EGFP、LV-EGFP對(duì)hADSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與MOI值呈正相關(guān)。MTT顯示Ad5F35-EGFP在高M(jìn)OI值（800）檢測(cè)A值與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)導(dǎo)EGFP的hADSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)14天可向成骨、成脂方向分化。結(jié)論:與腺病毒相比，慢病毒能夠更為安全、有效地感染體外培養(yǎng)hADSCs，并長(zhǎng)期表達(dá)外源基因，是研究基因修飾hADSCs的理想載體。

[關(guān)鍵詞]人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；基因治療；腺病毒；慢病毒

[中圖分類號(hào)]Q343.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）03-0342-04

Transduction of human adipose tissue-derived stromal cells using lentiviral vector and adenoviral vector: a comparative study

LI Dan，QIAO Qun，WANG Xiao-jun，QIAN Jian-ping

（Plastic & Aesthetic Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Beijing 100032，China）

Abstract： Objective To compare the efficiency of human adipose tissue-derived stromal cells (hADSCs) transduced by adenoviral vector and lentiviral vector. Methods Adipose tissues were isolated to obtain hADSCs. Ad5F35-EGFP and LV-EGFP were constructed and transduced hADSCs at multiple of infection MOI ranging from 0,25,50,100,200,400,800. At 1,3,7,14,21d post transduction,EGFP positive was detected by fluorescence microscopy and flow cytometry (FCM), which was followed by cell proliferation determination assessed with MTT assay at different MOIs. After induction of hADSCs modified with EGFP, von Kossa staining and red oil O staining were performed to test the formation of calcium and oil concentration. Results hADSCs's marker CD31,CD34,CD45,CD106 and HLA-DR were negative,CD29,CD44,CD49d,CD105,CD166 were positive. Fluorescence microscopy detected high EGFP. signal with hADSCs at 1d to 7d after infection by Ad5F35-EGFP and high EGFP signal with hADSCs at 21d after infection by LV-EGFP.FCM results showed that MOI of Ad5F35-EGFP and LV-EGFP enhanced transduce efficiency of hADSCs in a dose-dependent manner. MTT assay showed that Ad5F35-EGFP( MOI=800) A had great contrast with control group（P<0.01）. ADSCs encoding EGFP after differentiation into adipogenic and osteogenic lineages after lentiviral and adenoviral transduction. Conclusion Lentivirual vectors applied at high MOIs can result in integration and long-term gene expression.

Key words: human adipose tissue-derived stromal cells; gene therapy; adenovirus; lentivirus

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs) 是一類與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似，具有多向分化潛功能的成體干細(xì)胞[1]。Zuk等在脂肪抽吸物中成功分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSC），并發(fā)現(xiàn)其具有向脂肪、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能[2]。對(duì)hADSCs進(jìn)行基因修飾及標(biāo)記示蹤，已成為研究其分化調(diào)控機(jī)制及細(xì)胞基因治療的熱點(diǎn)。病毒載體系統(tǒng)以其較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和良好的靶向性在基因治療中應(yīng)用廣泛，不同類型病毒載體具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。本研究比較攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的梯度重組腺病毒（Adenovirus,Ad）及慢病毒（Lentivirus,LV）載體對(duì)體外培養(yǎng)hADSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)水平，并觀察該基因修飾對(duì)hADSCs分化的影響，為進(jìn)一步研究利用hADSCs進(jìn)行基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1 hADSCs分離、培養(yǎng)擴(kuò)增、細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)鑒定：脂肪組織取自在北京協(xié)和醫(yī)院整形美容外科接受腹部脂肪抽吸術(shù)的健康青年女性（5例），采取組織前均簽署知情同意書(shū)。無(wú)菌條件下，在局部腫脹麻醉下采用注射器法抽取50ml顆粒脂肪組織，靜置30min，去除上清液體，應(yīng)用0.075%I型膠原酶（Sigma）37℃水浴震蕩消化30min細(xì)胞分散，應(yīng)用等量含10%胎牛血清（HYCLONE）的低糖DMEM（GIBCO）中和膠原酶，800×g離心10min，重懸接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合至70%～80%后，以0.05%胰蛋白酶/EDTA消化，1:2比例傳代[3]。細(xì)胞接種后每次換液時(shí)用倒置相差顯微鏡（Olympus）觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)與形態(tài)變化。取培養(yǎng)的第3代hADSCs經(jīng)過(guò)消化離心(1000r/min，5min)后細(xì)胞重懸；細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁸/L，分別于小鼠抗人CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD106、CD105、CD166、CD49d和HLA-DR單克隆抗體（Santa Cruse）室溫反應(yīng)30min，PBS洗滌2次后于FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig-G（北京中杉金橋）避光作用30min，PBS重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志。

1.2 重組腺病毒、慢病毒載體體外感染hADSCs：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的病毒載體均攜帶巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白( EGFP)報(bào)告基因：5型、外殼纖維為35型嵌合型重組腺病毒（Ad5F35-EGFP）滴度為9×109 pfu/ml；第三代慢病毒（LV-EGFP），滴度為2×10⁸TU/ml，由北京本原正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司提供。采用第3代hADSCs，按每孔1×105接種到24孔板中，1天后細(xì)胞貼壁，將Ad5F35-EGFP及LV-EGFP分別以感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI）=0、25、50、100、200、400、800，其中MOI=0為對(duì)照組，加入到hADSCs細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后，培養(yǎng)液更換為含10%FCS的L-DMEM。

1.3 重組腺病毒、慢病毒載體對(duì)體外培養(yǎng)hADSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及增殖的影響：病毒載體對(duì)hADSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率用報(bào)告基因EGFP的表達(dá)來(lái)反映。分別于感染后1、3、7、14、21天，感染細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡（LSN 510，Zeiss）下觀察EGFP的表達(dá)，以表達(dá)EGFP細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。同時(shí)各組感染細(xì)胞分別加入0.25%胰蛋白酶消化，250μl PBS重懸后于200目濾網(wǎng)過(guò)濾送檢，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)各組EGFP陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行定量分析。MTT法觀察Ad5F35-EGFP及LV-EGFP對(duì)hADSCs增殖的影響：取感染后0、1、2、3、4、5、6、7天作為檢測(cè)點(diǎn)，向各孔加入MTT (Sigma) 20μl，37℃,5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h后吸棄上清, 加入150μlDMSO(Sigma)后輕柔振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-rad）490nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值A(chǔ)，計(jì)算平均值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4轉(zhuǎn)基因hADSCs體外誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)：病毒載體感染后第3天，各組轉(zhuǎn)導(dǎo)EGFP基因的hADSCs經(jīng)消化以每孔3×105接種至6孔板中，待細(xì)胞融合80%時(shí)，進(jìn)行體外分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。在倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察并攝影。

1.4.1 轉(zhuǎn)基因hADSCs向成骨細(xì)胞分化：細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)分化體系即地塞米松（10-7mol/L）、β-甘油磷酸鈉（10mmol/ L）、維生素C（50mg/L）中誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，用von Kossa染色法檢測(cè)鈣化小結(jié)。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因hADSCs向成脂細(xì)胞分化：細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)分化體系即地塞米松（10-6mol/L）、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤IBMX（0.5mmol/L）、胰島素（10μg/ml），吲哚美辛（100μmol/l）中誘導(dǎo)14天，油紅O染色法檢測(cè)脂滴。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)檢測(cè)組間差異，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1體外分離、培養(yǎng)hADSCs的形態(tài)觀察與鑒定：原代細(xì)胞接種1天后在倒置顯微鏡下可觀察到散在的多角形貼壁細(xì)胞，7天后細(xì)胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形(圖1)，細(xì)胞融合后呈放射狀或漩渦狀，生長(zhǎng)迅速，倍增時(shí)間約24～28 h，P3代至P10代細(xì)胞間無(wú)明顯形態(tài)變化。取第3代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：細(xì)胞表面分子CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166呈陽(yáng)性表達(dá)，CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR呈陰性表達(dá)(圖2)。CD49d和CD106是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的區(qū)分標(biāo)記[1]，表型鑒定可初步確定為hADSCs。

2.2Ad5F35-EGFP及LV-EGFP對(duì)體外培養(yǎng)hADSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率：Ad5F35-EGFP（MOI=25、50、100、200、400）感染hADSCs，1天后倒置顯微鏡即可觀察到EGFP陽(yáng)性細(xì)胞，隨著病毒量增加，表達(dá)EGFP的細(xì)胞陽(yáng)性率增加。感染后3天各組EGFP表達(dá)達(dá)到高峰，并可維持至感染后7天，此后至14天左右，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少，熒光強(qiáng)度逐漸降低至至消失。Ad5F35-EGFP（ MOI=800）對(duì)hADSCs有細(xì)胞毒性(部分細(xì)胞皺縮死亡)，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。LV-EGFP（MOI=25、50、100、200、400、800）感染hADSCs后，1天觀察到少量細(xì)胞表達(dá)EGFP，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，直至7天表達(dá)EGFP細(xì)胞數(shù)量及亮度不再有明顯變化，此時(shí)MOI=25轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為（15.5±1.4）%，隨著MOI增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率逐漸增加，最高至MOI=400時(shí)為（92.0±1.7）%，MOI=800時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無(wú)顯著提高。LV-EGFP感染后21天仍可見(jiàn)大量EGFP陽(yáng)性細(xì)胞。感染后7天相同MOI值條件下，Ad5F35-EGFP對(duì)細(xì)胞的感染效率均高于LV-EGFP(P<0.05)。流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)感染后hADSCs表達(dá)EGFP陽(yáng)性率結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3MTT法檢測(cè)結(jié)果：Ad5F35-EGFP及LV-EGFP在MOI值=25、50、100、200、400時(shí)感染hADSC所檢測(cè)A值，與對(duì)照組（MOI=0）相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。在高M(jìn)OI（800）條件下，Ad5F35-EGFP對(duì)hADSC增殖有抑制作用，LV-EGFP與對(duì)照組A值相比無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

2.4轉(zhuǎn)基因hADSCs體外誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)

2.4.1 轉(zhuǎn)基因hADSCs成骨誘導(dǎo)分化：轉(zhuǎn)染EGFP基因的hADSCs經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系培養(yǎng)14天后，行Von Kossa染色發(fā)現(xiàn)有明顯的鈣化基質(zhì)沉積，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到成骨分化后的細(xì)胞仍然表達(dá)EGFP (圖3A，3B)。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因hADSCs成脂誘導(dǎo)分化： 轉(zhuǎn)染EGFP 基因的hADSCs經(jīng)過(guò)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系培養(yǎng)14天后，光鏡下可見(jiàn)80%以上的細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿脂肪小泡，油紅O染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)照體系不表達(dá)或只有微量表達(dá)。在倒置熒光顯微鏡下觀察到分化后的細(xì)胞仍然表達(dá)EGFP (圖4A、4B)。

3討論

hADSCs具有組織來(lái)源豐富，獲取效率高，可誘導(dǎo)分化為成骨、軟骨、脂肪、肌及神經(jīng)前體細(xì)胞，分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等細(xì)胞因子，以旁分泌方式促進(jìn)血管新生并保護(hù)缺氧細(xì)胞等特點(diǎn)[5-6]，在基因治療及組織工程再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子結(jié)果顯示：CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR陰性，CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166陽(yáng)性。其中CD105和CD166為干細(xì)胞標(biāo)志分子[7]；hADSCs表達(dá)CD49d，不表達(dá)CD106，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]；HLA-DR陰性表明其具有同種異體移植的可能性[8]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)所獲得的細(xì)胞可初步確定為hADSCs[9]。

選擇合適的載體將目的基因有效整合到hADSCs并保留其干細(xì)胞多向分化的特性，是研究hADSCs體內(nèi)、外分化潛能及跨胚層分化潛能的關(guān)鍵步驟。腺病毒載體靶細(xì)胞范圍廣，能感染復(fù)制分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞，感染效率及外源基因表達(dá)水平高，不整合入宿主細(xì)胞DNA，外源基因的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱[10]，被廣泛用于基因治療、基因疫苗等實(shí)驗(yàn)研究，其中Ad5F35型腺病毒載體對(duì)Ad5型腺病毒載體感染較差的細(xì)胞，特別是造血系統(tǒng)細(xì)胞、干細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高[11-12]。慢病毒載體是一類逆轉(zhuǎn)錄載體，其基因組能整合入宿主細(xì)胞基因組，持久穩(wěn)定表達(dá)外源基因?！暗谌甭《据d體，其基因組的3'LTR的增強(qiáng)子功能缺失，從而形成自滅活（Self-inactivation,SIN），具有良好的安全性；病毒包膜上嵌合了來(lái)自水泡口炎病毒的VSV-G蛋白，使病毒能感染分裂和非分裂細(xì)胞。與MuLV等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有致瘤活性相比，慢病毒載體未發(fā)現(xiàn)有致腫瘤活性[13]。

本實(shí)驗(yàn)使用了攜帶EGFP報(bào)告基因的Ad5F35與第三代LV載體分別對(duì)hADSCs進(jìn)行感染，檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和外源基因表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ad5F35-EGFP、LV-EGFP均可以有效感染體外培養(yǎng)的hADSCs并表達(dá)外源基因EGFP。Ad5F35-EGFP感染hADSCs后1周內(nèi)可見(jiàn)EGFP高表達(dá)，而LV-EGFP感染hADSCs后21天，仍能觀察到EGFP高表達(dá)。在相同MOI值條件下，Ad5F35-EGFP對(duì)hADSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均高于LV-EGFP。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與病毒的用量間存在量效關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到，Ad5F35-EGFP在高M(jìn)OI值（800）時(shí)對(duì)hADSCs有細(xì)胞毒性。因此，盡管Ad5F35對(duì)hADSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率略高于LV，但LV在外源基因表達(dá)時(shí)長(zhǎng)及安全性方面更具優(yōu)勢(shì)，LV作為hADSCs的外源基因修飾載體，具有良好的應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2009-01-28[修回日期]2009-02-12

編輯/張惠娟