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        英紅1號、英紅9號和祁門茶樹芽葉中嘌呤生物堿和茶多酚的HPLC-DAD-MS/MS分析*

        2009-05-08 01:57:26盧嘉麗王冬梅苗愛清楊得坡陳建萍
        關(guān)鍵詞:祁門芽葉嘌呤

        盧嘉麗,王冬梅,苗愛清,楊得坡,陳建萍

        (1. 中山大學(xué)藥學(xué)院,廣東 廣州 510080;2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,廣東 英德 513000;3. 香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,香港)

        嘌呤生物堿和茶多酚是茶Camelliasinensis葉中的主要活性成分,嘌呤生物堿主要是咖啡堿,一般占茶葉干質(zhì)量的2%~4%;茶多酚則包括兒茶素類(黃烷醇類)、黃酮及黃酮醇類、花青素類及酚酸化合物等幾大類,質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)茶葉干質(zhì)量的18%~36%[1],其中兒茶素類約為茶多酚總量的70%~80%。高效液相色譜法(HPLC)是茶多酚分離分析最常用的方法之一,但由于兒茶素類化合物結(jié)構(gòu)相似,使用二級管陣列檢測器(DAD)并不能準(zhǔn)確有效地鑒定出各個(gè)成分,若連接質(zhì)譜(MS)則能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。英紅1號、英紅9號是廣東省農(nóng)科院茶葉研究所培育的適制紅茶的大葉種優(yōu)良茶樹品種,祁門紅茶為小葉種紅茶品種,以其高香形秀享譽(yù)國內(nèi)外。本文選取這3個(gè)紅茶品種作為研究對象,采用HPLC-DAD-MS/MS技術(shù)對其芽葉中的嘌呤生物堿和茶多酚進(jìn)行了定性和定量分析,從而比較這3個(gè)茶樹品種在相同生長環(huán)境下芽葉中化學(xué)成分的組成特征。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        英紅1號、英紅9號和祁門紅茶的芽葉均采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園,按一芽三葉采摘后隔水蒸青5 min,80 ℃烘干,粉碎過40目篩,置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

        2種嘌呤生物堿對照品咖啡堿(CAF)和可可堿(TB)購自Sigma公司;8種兒茶素對照品(-)-沒食子兒茶素(GC)、(-)-表沒食子兒茶素(EGC)、(+)-兒茶素(C)、(-)-表兒茶素(EC)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、(-)-兒茶素沒食子酸酯(CG)購自Nacalai Tesque Inc.(Kyoto, Japan),純度均大于98%。超純水(Millipore,USA),乙腈為色譜純?nèi)軇?TEDIA,USA),甲酸為市售國產(chǎn)分析純試劑。

        1.2 HPLC-DAD-MS/MS分析條件

        Waters 600E高效液相色譜儀,配備Waters 600E四元梯度輸送泵系統(tǒng),Waters 717plus 自動(dòng)進(jìn)樣器,Waters 2996光電二極管陣列檢測器。Thermo Finnigan TSQ Quantum液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,Surveyor光電二極管陣列檢測器,Surveyor自動(dòng)進(jìn)樣器,ESI/APCI離子源。

        液相色譜條件:色譜柱Phenomenex Gemini C18(250 × 4.6 mm i.d., 5 μm),保護(hù)柱Phenomenex C18(4 × 3.0 mm i.d., 5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)和φ=1%甲酸水溶液(B),A∶B的組成比從4∶96(0 min)線形上升為25∶75(60 min);進(jìn)樣量:10 μL;流速:1 mL/min;柱溫:室溫;DAD掃描波長范圍:200~700 nm。

        質(zhì)譜條件:ESI離子化,正負(fù)離子同時(shí)檢測;離子化電壓:4 kV;噴霧電壓:3.5 kV;鞘氣壓力:35 Arb;輔助氣壓力:11 Arb;毛細(xì)管溫度:350 ℃;毛細(xì)管電壓:35 V;m/z掃描范圍:150~1 500 amu;MS2碰撞能量:35 eV。

        1.3 供試品溶液、對照品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

        取0.5 g茶樣,精密加入50 mL乙腈-水(1∶1,體積比),室溫下超聲提取20 min,0.2 μm微孔濾膜過濾后備用。

        精密稱取對照品適量,用水溶解后定容,得到對照品混合溶液中TB、GC、EGC、CAF、C、EC、EGCG、GCG、ECG的質(zhì)量濃度分別為0.04、0.04、1.02、0.53、0.05、0.48、3.05、0.04、0.46 mg/mL;將上述混合溶液繼續(xù)稀釋1.25、2.5、5、10、20倍,得到6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對照品溶液,每個(gè)質(zhì)量濃度分別進(jìn)樣3次,以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1,結(jié)果表明各化合物在測定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。對此測定方法進(jìn)行方法學(xué)考察,精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均在合格范圍,各成分的平均加樣回收率在97.11%~105.36%之間,RSD不大于3.11%。

        表1 嘌呤生物堿和兒茶素類化合物定量分析的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

        2 結(jié) 果

        2.1 英紅9號芽葉中嘌呤生物堿和茶多酚的定性分析

        以英紅9號為例,HPLC色譜圖(275 nm)和正、負(fù)離子總離子流色譜圖,兒茶素混合對照品的HPLC色譜圖(275 nm)如圖1所示。通過與對照品的保留時(shí)間、紫外吸收光譜以及質(zhì)譜信息進(jìn)行比較,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-5],鑒定出11個(gè)化合物,列于表2中,包括2種嘌呤生物堿可可堿和咖啡堿,7種兒茶素類化合物GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG。此外,還鑒定出5-沒食子酰奎寧酸酯(5-galloylquinic acid)和山柰酚-3-蕓香糖苷(kaempferol-3-rutinoside)2種非兒茶素類茶多酚。

        表2 英紅9號芽葉中多酚類化合物和嘌呤生物堿的保留時(shí)間、紫外吸收及質(zhì)譜特征

        圖1 英紅9號芽葉(A-1~A-3)和兒茶素混合對照品(B)的HPLC-UV-MS色譜圖

        2.2 英紅1號、英紅9號和祁門茶樹芽葉中嘌呤生物堿和兒茶素類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

        英紅1號、英紅9號和祁門茶樹芽葉的HPLC色譜圖(275 nm)見圖2,2個(gè)嘌呤生物堿和7個(gè)兒茶素類化合物的定量結(jié)果列于表3。英紅1號、英紅9號和祁門茶樹芽葉中的嘌呤生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本相近,可可堿約為0.2%,咖啡堿約為3%。這3個(gè)茶樹品種的兒茶素類總量均大于20%,但相同兒茶素類化合物在不同品種之間的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻有較大差異,其中英紅1號和祁門比較接近,EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,分別為14.53%、10.64%。英紅9號的兒茶素類成分組成比例較特殊,質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的不是EGCG(4.68%),而是ECG(8.65%);而且C(1.55%)、EC(3.4%)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于英紅1號和祁門。

        圖2 英紅1號(A)、英紅9號(B)和祁門茶樹(C)芽葉的HPLC色譜圖(275 nm)

        表3 英紅1號、英紅9號和祁門茶樹芽葉中嘌呤生物堿和兒茶素類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3)

        3 討 論

        通過HPLC-DAD-MS/MS分析,在英紅1號、英紅9號和祁門茶樹芽葉中準(zhǔn)確有效地鑒定出了2種嘌呤生物堿,7種兒茶素類化合物以及2種非兒茶素類茶多酚。英紅1號是由阿薩姆種子經(jīng)單株選育而成的無性系品種,英紅9號是在云南大葉種有性后代中經(jīng)單株選育而成的無性系品種,兩者均是廣東省農(nóng)科院茶葉研究所選育而成的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大葉紅茶品種;祁門紅茶品種原產(chǎn)地為安徽省祁門縣。這3個(gè)紅茶茶樹品種雖然在同一個(gè)茶園環(huán)境下種植生長,但是芽葉中兒茶素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組成仍然反映出這3個(gè)品種的生化特性差異。英紅1號和英紅9號是大葉種C.sinensisvar.assamica,由于葉面積大,接受光照多,利于糖代謝,轉(zhuǎn)化成多酚類也豐富[1],因此兒茶素類總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比小葉種C.sinensisvar.sinensis的祁門紅茶品種較高。一般來說,茶葉中兒茶素類化合物的組成中以EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,遠(yuǎn)高于其它兒茶素類化合物,其次是ECG和EGC,但在云南大葉種中ECG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻高于EGCG,而且EC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也高于EGC[6-7]。茶葉中兒茶素的生物合成首先形成的是EC和C等非酯型兒茶素,再經(jīng)過羥基化或沒食子?;?,才形成了沒食子兒茶素和兒茶素沒食子酸酯[1]。被認(rèn)為保持了原始特性的云南大葉種因此含有較多的EC、C和ECG。本研究中英紅9號的兒茶素類成分的組成也充分反映了云南大葉種的這一特性。

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