【摘要】目的：觀察自由基清除劑對大鼠急性脊髓損傷后NMDAR1表達(dá)的影響，探討自由基清除劑對大鼠脊髓損傷的保護(hù)及促神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。方法：采用改良Allen法制作SD大鼠脊髓中度損傷模型，將模型鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組各24只。實驗組按3mg/kg的劑量將自由基清除劑依達(dá)拉奉用0.9％氯化鈉溶液稀釋后，每隔12h腹腔注射1次，給藥時間為30min，共14d。對照組采用同樣方式給予0.9％氯化鈉溶液。觀察脊髓組織的病理改變及用免疫組化方法測定1天、3天、7天和14天不同時間點大鼠脊髓內(nèi)離子型受體N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)表達(dá)的變化。結(jié)果:與外傷對照組比較，依達(dá)拉奉治療組MMDAR1免疫陽性細(xì)胞數(shù)在1d時較低（P<0.05），3d、7d、14d

【關(guān)鍵詞】自由基清除劑;大鼠;脊髓損傷;NMDAR

【中圖分類號】R651.2【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)12-0041-02

脊髓損傷（SCI）后軸突再生和功能恢復(fù)一直是骨科及神經(jīng)外科尚未解決且倍受關(guān)注的課題。隨著脊髓損傷機(jī)制研究的發(fā)展，人們認(rèn)為自由基在局部缺血——再灌注損傷機(jī)制中起了重要作用[1]，而依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑。本實驗以脊髓損傷大鼠模型為觀察對象，觀察觀察自由基清除劑對大鼠急性脊髓損傷后NMDAR1表達(dá)的影響，以探討自由基清除劑對大鼠脊髓損傷的保護(hù)及促神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物成年雄性SD大鼠54只，平均體重250-300克，由南華大學(xué)實驗動物中心提供。置于室溫20士2℃，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，12小時晝夜自然光照條件下生活，自由飲水。

1.1.2主要試劑及儀器設(shè)備 兔抗NMDAR1單克隆抗體（1：200稀釋）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；SM2000R 1400型LEICA切片機(jī)；PYX-DHS型電熱恒溫箱；AY120型電子天平(Shimadzu公司)； PB-10型pH計(Sarto．flus公司)；Nikon Eclipse 80i顯微鏡；SimPCI圖像處理軟件系統(tǒng)(Compix Inc．)；OLYMPUS照相顯微鏡。

1.2方法

2.1試驗分組48只健康大鼠，隨機(jī)分為實驗組和對照組各24只，空白對照組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2.2造模與治療參照改良的AIIenWD法[2]，制成中度脊髓損傷動物模型。取后正中切口，以T8節(jié)脊髓為中心顯露直徑為3.0mm的圓形區(qū)，將椎板全部切除，顯露硬脊膜并保持其完整性作為脊髓損傷區(qū)。Allens法用致傷力（砝碼質(zhì)量10g，下落高度2.5cm）損傷脊髓，見大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動后雙后肢癱瘓，表明撞擊成功。然后縫合切口。造模成功后，即給予治療。實驗組按3mg/kg的劑量將自由基清除劑依達(dá)拉奉用0.9％氯化鈉溶液稀釋后，每隔12h腹腔注射1次，給藥時間為30min，共14d。對照組采用同樣方式給予0.9％氯化鈉溶液。

2.3標(biāo)本的取制大鼠深度麻醉后取仰臥位，以4℃的生理鹽水100ml迅速經(jīng)心臟灌注，繼而400ml的4%多聚甲醛（0.1mol/L，PH7.3）快速滴注，約30 min滴畢。取損傷相應(yīng)節(jié)段脊髓組織，置于10%中性甲醛于4°C后固定24h后常規(guī)石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，貼片用于HE染色及免疫組化檢測。

2.4免疫組化方法石蠟切片脫蠟至水（二甲苯15min*2，100%酒精3min，95%酒精3min，75%酒精3min，雙蒸水3min，PBS3min）；置0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液中微波修復(fù)10min，滴加10％正常山羊血清工作液，室溫下孵育10-15分鐘，傾去血清，不洗；滴加適當(dāng)稀釋的一抗，室溫下孵育2小時；PBS液洗5分鐘×3次；滴加生物素化二抗工作液，室溫下孵育10-15分鐘，PBS液洗5分鐘×3次；加入ABC復(fù)合物（1：100），室溫下孵育2h，PBS液洗5分鐘×3次。然后DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。陰性空白對照以PBS緩沖液代替一抗。

2.5圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理在顯微鏡下觀察陽性表達(dá)分布情況。于40×10倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個視場，每個視場選取5個陽性表達(dá)區(qū)域計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)采用±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較用t檢驗分析。

2結(jié)果

2.1病理改變正常大鼠脊髓橫切面結(jié)構(gòu)，含有大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)致密，髓鞘存在。外傷組及依達(dá)拉奉治療組大體標(biāo)本均可見脊髓出血、腫脹、充血。外傷1d組可見脊髓中央管周圍灰質(zhì)神經(jīng)元(LⅢ～LⅦ)和前角運(yùn)動神經(jīng)元出現(xiàn)明顯變性壞死。細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)不清、完整性破壞，部分胞核固縮或消失；另有部分細(xì)胞完全消失為空泡，或僅為殘留的壞死碎片。依達(dá)拉奉治療組損傷表現(xiàn)相當(dāng)，無明顯差別。外傷3d、7d、14d組脊髓組織可見不同大小的缺損區(qū)，缺損區(qū)內(nèi)散布著組織碎片、殘渣以及數(shù)量不等的紅細(xì)胞，甚至可見到明顯斑片狀出血，周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生，并有大量的炎性細(xì)胞浸潤，部分出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹、核固縮等病理學(xué)表現(xiàn)。7d時炎性反應(yīng)達(dá)高峰，14d時炎性反應(yīng)減輕。依達(dá)拉奉治療組神經(jīng)細(xì)胞損傷程度則明顯較輕，偶見胞漿紅染和細(xì)胞核輕度濃縮，空泡變性和炎性細(xì)胞浸潤程度均較輕。

2.2免疫組化染色結(jié)果正常大鼠脊髓有適量NMDAR1免疫陽性表達(dá)，免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈深棕色，主要主要表達(dá)于胞膜、胞漿，細(xì)胞核呈陰性。光鏡下可見免疫陽性細(xì)胞被染成棕黃色。外傷組NMDAR1免疫陽性細(xì)胞表達(dá)1d時明顯增多，然后開始下降，3d時明顯低于正常，7d、14d時逐漸恢復(fù)，但仍然低于正常。與外傷對照組比較，MDAR1免疫陽性細(xì)胞數(shù)在1d時較低（P<0.05），3d、7d、14d時則較高（P<0.05）。說明治療早期能夠在一定程度上抑制NMDAR1的高水平表達(dá)，而晚期則促進(jìn)NMDAR1的表達(dá)。見表1。與空白對照組、外傷對照組比較，P<0.05，即差異具有顯著性。

3討論

目前研究認(rèn)為，脊髓束的損傷機(jī)制在于脊髓運(yùn)動神經(jīng)元對局部缺血的敏感性，而在局部缺血—再灌注損傷機(jī)制中，自由基起了重要作用，故從這方面人手減輕缺血—再灌注損傷已成為研究熱點[1]。氧自由基對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷主要包括以下幾個方面[3-6]：①細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，磷脂被降解而變性失活；②細(xì)胞膜對Na+-Ca+2以及大分子物質(zhì)通透性增加，發(fā)生細(xì)胞毒性水腫；③細(xì)胞的生物酶喪失活性或轉(zhuǎn)化為有害物質(zhì)；④攻擊線粒體膜，消耗大量的能量，同時可抑制線粒體的呼吸，使能量迅速耗竭；⑤破壞其它膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；⑥攻擊DNA、RNA和蛋白質(zhì)引起基因突變、酶活性喪失及細(xì)胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和解體；⑦引起興奮性氨基酸釋放增加，興奮性氨基酸，細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基生成增加和代謝性酸中毒三者相輔相成。谷氨酸通過阻礙胱氨酸的攝取從而導(dǎo)致谷胱甘肽水平下降以及細(xì)胞內(nèi)氧自由基的堆積，此種細(xì)胞損傷作用被稱為“氧化性谷氨酸毒性”[7]。另有研究表明，NMDAR過度激活介導(dǎo)的神經(jīng)元急性溶解壞死是缺血損傷的重要因素。其部分機(jī)制在于：NMDAR與鈣通道偶聯(lián)，谷氨酸作用于NMDAR，打開鈣通道，使胞外鈣流入胞內(nèi)增多，促進(jìn)自由基的生成。而自由基又可以抑制谷氨酸再攝取，使突觸間隙谷氨酸大量聚集，兩者之間形成惡性循環(huán)。

NMDAR是由NMDAR1和NMDAR2兩種亞單位構(gòu)成的異聚體，其中NMDAR1是構(gòu)成受體通道的必須的組分，是NMDAR藥理學(xué)和電生理學(xué)特性的基礎(chǔ)[8]。因此，NMDAR1的蛋白表達(dá)能直接反映NMDAR的功能及狀態(tài)。本研究通過觀察NMDAR1的變化，從分子水平上來了解自由基清除劑治療的療效。實驗結(jié)果表明，超短波治療對脊髓損傷后NMDAR1的表達(dá)存在明顯的“雙向調(diào)節(jié)”，即可明顯降低急性期的表達(dá)，并上調(diào)后期的表達(dá)?，F(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究表明，正常情況下，谷氨酸與NMDAR結(jié)合，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能，促進(jìn)神經(jīng)元生長發(fā)育，傳遞信息，參與學(xué)習(xí)、記憶等作用。故我們推測，自由基清除劑在早期可通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，降低細(xì)胞外谷氨酸濃度，抑制NMDA受體的過度激活，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，達(dá)到減輕受損神經(jīng)組織水腫，對神經(jīng)元起保護(hù)作用；晚期則促進(jìn)激活NMDA受體，對突觸重建及神經(jīng)功能的恢復(fù)起促進(jìn)作用。

目前，自由基清除劑如依達(dá)拉奉，作為治療腦損傷、腦卒中的一線藥物，已在許多醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和神經(jīng)外科廣泛使用，許多醫(yī)院的骨外科開始嘗試將自由基清除劑用于治療脊髓神經(jīng)損傷，并取得了一定療效。本研究客觀地評價了自由基清除劑治療脊髓損傷大鼠模型的療效，以進(jìn)一步說明自由基清除劑具有應(yīng)用于臨床的巨大潛力。

參考文獻(xiàn)

[1]TAKAHASHI G，SAKURAI M，ABE K，et al. MCI186 Prevents Spinal Cord Damage and Affects Enzyme Levels of Nitric Oxide Synthase and Cu/Zn Superoxide Dismutase after Transient Ischemia in Rabbits[J].Thorac Cardiovasc Surg（S0171—6425），2003，126（5）：1461-1466.

[2]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocaion of spinal colum[J].JAMA，1911，57：878-880.

[3]Carmody RJ， Cotter TG，et，al. Oxidative stress induces caspase-independent retinal apoptosis in vitro.Cell Death Differentiation， 2000， 7: 282-291.

[4]J. Kriz， G. Zupan and A. Simonic. Differential effects of dihydropyridine calcium channel blockers in kainic acid- induced experimental seizures in rats. 52 (2003)， 215 225.

[5]Ozaki M， et，al. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 2000;14:418 429.

[6]Kobayashi T，Kuroda S，Tada M，et al. Calcium induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the brain:its biochemical characteristics and implication in ischemic neuronal injury. Brain Res，2003，960:6270.

[7]Ozaki M， et，al. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 2000;14:418–429.

[8]韓太真.NMDA受體的結(jié)構(gòu)與藥理學(xué)特性［J］.心理科學(xué)進(jìn)展，2008，16（3）：464-474

(收稿日期：2009.03.10)