【摘要】自然界僅有RNA病毒以RNA作為基因載體。依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）在這種病毒的增殖復(fù)制期起到了非常重要的作用，它一方面以病毒RNA為模板復(fù)制子代病毒的基因，另一方面也將病毒增殖期間需要的蛋白質(zhì)和酶類的基因轉(zhuǎn)錄成為mRNA，所以它擔(dān)負(fù)了復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶雙重功能。由于酶的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性差，在分子水平對(duì)它進(jìn)行分析存在許多困難。人類和動(dòng)物的許多嚴(yán)重疾病是由RNA病毒引起的，如人的SARS、流感、甲肝、丙肝、艾滋病、麻疹、出血熱、腦炎、脊灰、某些腫瘤；動(dòng)物的口蹄疫、豬瘟、雞瘟等等。RNA病毒不僅嚴(yán)重威脅人類健康，也給工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，因此加強(qiáng)RNA病毒研究不僅是開啟生命起源神秘大門的鑰匙，也是保護(hù)人類健康，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生物多樣性研究與保護(hù)的重要途徑。本文僅就RNA病毒的RNA聚合酶以及反向遺傳學(xué)這兩個(gè)方面的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)單介紹。

【關(guān)鍵詞】RNA病毒；RNA聚合酶

【中圖分類號(hào)】R373【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2009)12-0025-03

地球上的原始生命形態(tài)是從RNA開始的。在RNA作為生命起源的進(jìn)化歷程中，RNA病毒起了不可替代的作用。自然界中RNA病毒的種類和數(shù)量都堪稱病毒之冠，其基因組轉(zhuǎn)錄復(fù)制的多樣性也可謂病毒之首。所有的RNA病毒在病毒基因組的復(fù)制過(guò)程中都編碼一個(gè)依賴RNA的RNA聚合酶。此酶與宿主的蛋白質(zhì)（有時(shí)還需病毒的蛋白質(zhì)）一起發(fā)揮催化功能[2，3]。在其序列保守性方面，絕大多數(shù)RNA聚合酶蛋白已經(jīng)被闡明；然而關(guān)于這類酶的催化活性，到目前為止只有少數(shù)幾種已從生化的角度得到研究闡述，這包括：Qβ復(fù)制酶亞單位II[4]，脊髓灰質(zhì)炎病毒的3D Pol蛋白[5～7]，丙型肝炎病毒NS5B蛋白[8～10]和煙草脈斑駁病毒(TVMV)的核內(nèi)包涵體蛋白NIB[11]。

Kamer和Argos于1984年闡明了幾種序列基元，它們?cè)谀承﹦?dòng)物和植物的正鏈RNA病毒的RDRPs和脊髓灰質(zhì)炎病毒的3D聚合酶中廣泛存在。以后的研究在此基礎(chǔ)之上又?jǐn)U展至更廣范圍的病毒和更多的基序。到如今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8個(gè)保守的RDRP基序[12，13]?，F(xiàn)已知這8個(gè)保守基序中的4個(gè)存在于所有聚合酶的“掌部”結(jié)構(gòu)域中的催化活性部位[14，15]。當(dāng)前，對(duì)于脊髓灰質(zhì)炎病毒的3D Pol蛋白的研究日趨深入[14]。這項(xiàng)工作的目的是以脊髓灰質(zhì)炎病毒的聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)做指導(dǎo)，利用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)多種RDRPS的二級(jí)結(jié)構(gòu)并對(duì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行分析。目前面臨的問題有：其它病毒的RDRPS也具有與脊髓灰質(zhì)炎病毒的聚合酶相同的結(jié)構(gòu)嗎？它們也具有脊髓灰質(zhì)炎病毒的聚合酶所具有的獨(dú)特區(qū)域嗎？它們?cè)谝恢滦蛄械南嗨茀^(qū)域中也存在可以識(shí)別的掌部基序嗎?

RDRP的結(jié)構(gòu)和功能的分析不可能完全游離于其他三種聚合酶之外，所以在此簡(jiǎn)要介紹一下依賴DNA的DNA聚合酶（DDDPs）、依賴DNA的RNA聚合酶（DDRPs）和逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的晶體學(xué)研究。第一個(gè)結(jié)構(gòu)研究清楚的是Escherichia Coli的DNA聚合酶I的Klenow片段（KF），這是一個(gè)DDDP[15]。此酶的整體形狀好象一只帶有手指、手掌和大拇指亞結(jié)構(gòu)域的“右手”（圖A）。在1992年報(bào)道了HIV-I RT的結(jié)構(gòu)[16]。兩種聚合酶的結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，盡管在這兩種蛋白之間缺乏序列上的一致性，它們都具有“右手”形狀的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這揭示相對(duì)于一級(jí)序列，酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)似乎更具保守性。KF和HIV RT的“手掌”亞結(jié)構(gòu)域可以互相重疊，被認(rèn)為是同源的[17]。兩種酶的“大拇指”結(jié)構(gòu)域大多數(shù)是α-螺旋，但是它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)的排列并不相同。HIV RT的“手指”亞結(jié)構(gòu)域大部分由B-折疊組成，而KF的“手指”亞結(jié)構(gòu)域大部分由α-螺旋組成[17]。而且， KF，T7 RPO和HIV RT中編碼“手指”和“大拇指”亞結(jié)構(gòu)域的基因序列的線性排列也互不相同（圖2）。

Sousa等人于1993年描述了T7 RNA聚合酶(T7 RPO)的晶體結(jié)構(gòu)。此酶的“手指”、“手掌”和“大拇指”亞結(jié)構(gòu)域均與KF極為相似。這提示KF和T7 RPO中主要由α-螺旋構(gòu)成的“手指”亞結(jié)構(gòu)域是依賴DNA的聚合酶的一個(gè)特點(diǎn)；而HIV RT中主要由β-折疊構(gòu)成的“手指”是那些既能以RNA又能以DNA為模板的聚合酶的一個(gè)特點(diǎn)[16， 18]。

接下來(lái)的關(guān)于聚合酶與DNA引物-模板共聚體的研究更增加了我們對(duì)于聚合酶的結(jié)構(gòu)與功能的理解。迄今為止已經(jīng)獲得了HIV RT的聚合酶共聚體的結(jié)構(gòu)[19];許多DDDPs，包括E.Coli(KF;[20])，B.Stearo Thermo PhiluS[21]和T.A Quaticus(TAQ;22)的同種的Pol I的共聚體結(jié)構(gòu);以及T7 DNA聚合酶的共聚體結(jié)構(gòu)[23]。這些研究使我們逐漸明了了聚合酶-模板之間發(fā)生的相互作用和催化反應(yīng)。引物-模板與“手指”、“手掌”和“大拇指”亞結(jié)構(gòu)域通過(guò)直接的由水介導(dǎo)的主鏈的內(nèi)部作用而定位，這使得酶與DNA能以一種序列各自獨(dú)立的方式結(jié)合。蛋白和堿基間的唯一接觸是在活性位點(diǎn)附近，其作用是保證合成的忠實(shí)性。DNA模板-引物以A-構(gòu)象和B-構(gòu)象結(jié)合成雜合體（圖A）。盡管活性位點(diǎn)上游4-5個(gè)堿基對(duì)處的雙螺旋是B-構(gòu)象，在接近活性位點(diǎn)處的堿基對(duì)卻因具有寬而平的小溝而使人聯(lián)想起A-構(gòu)象的DNA雙螺旋。這樣，一個(gè)嘌呤的N3位和一個(gè)嘧啶的O2位可以特定的氫鍵而形成新的堿基對(duì)。這兩個(gè)基團(tuán)在G：C堿基對(duì)和A：T堿基對(duì)中表現(xiàn)一致[24]而且可以和通常的Watson-Crick形式的堿基對(duì)相互識(shí)別。

這些研究也說(shuō)明核苷酸結(jié)合位點(diǎn)是由“手指”、“手掌”亞結(jié)構(gòu)域的氨基酸、模板的堿基以及臨近的堿基對(duì)經(jīng)復(fù)雜的內(nèi)部作用而構(gòu)成的。這個(gè)“口袋”有助于選擇正確配對(duì)的核苷酸，因?yàn)槿绻清e(cuò)配，核苷酸就不能以合適的幾何構(gòu)型進(jìn)行結(jié)合。最初，我們猜想模板DNA穿過(guò)酶的“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域間的狹縫[15，16]，然而，晶體結(jié)構(gòu)顯示事實(shí)并非如此。在晶體結(jié)構(gòu)中，引物鏈的3’末端位于保守的天冬氨酸附近，這些天冬氨酸在催化活性中心起關(guān)鍵作用；而模板鏈的5’末端在酶的“手指”和“手掌”亞結(jié)構(gòu)域的影響下急拐了一個(gè)90度的彎（圖1）。酶的“手指”和“大拇指”亞結(jié)構(gòu)域的位置因是否結(jié)合了模板鏈而有所不同。當(dāng)沒有結(jié)合模板鏈時(shí)，聚合酶處于一種開放的狀態(tài)。然而，當(dāng)模板結(jié)合上來(lái)以后，酶的“手指”和“大拇指”亞結(jié)構(gòu)域就合攏，形成一個(gè)“鉗子”鉗住DNA鏈。“大拇指”的指尖在小溝中活性位點(diǎn)上游4-5bp處經(jīng)水介導(dǎo)直接或間接地與磷酸二酯主鏈發(fā)生相互作用[23]。在有模板結(jié)合時(shí)，“鉗子”的“大拇指”部分被認(rèn)為是固定不動(dòng)的；而“手指”亞結(jié)構(gòu)域的一部分可以隨著每一個(gè)堿基對(duì)的形成而打開和關(guān)閉[22，23]。

催化反應(yīng)包括據(jù)信在所有的聚合酶中都會(huì)發(fā)生的保守的羧化作用[17，25]。這種“二金屬離子”機(jī)制最初是在類似的DNA聚合酶I的3’-5’核酸外切活性機(jī)制的基礎(chǔ)上提出的[17，26]。在此機(jī)制之中，兩個(gè)金屬離子通過(guò)兩個(gè)羧基、水、生長(zhǎng)鏈的3’-OH和三磷酸腺苷中非酯化的氧原子聯(lián)系在一起（圖3）。金屬A激活α磷酸的3’-OH的親核攻擊，而金屬B穩(wěn)定焦磷酸防止其脫離集團(tuán)。

病毒RNA聚合酶的氨基酸序列比較研究證實(shí)保守區(qū)域有下面三種功能：包括RNA聚合、三磷酸核苷酸 (NTP)結(jié)合、模板和產(chǎn)物結(jié)合的RNA聚合酶功能；對(duì)分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)或模板 -產(chǎn)物雙倍體的RNA進(jìn)行解鏈的螺旋酶功能；RNA戴帽的甲基轉(zhuǎn)移酶功能。典型的GDD三肽現(xiàn)在被認(rèn)為是RNA聚合酶的明顯標(biāo)記，許多情況下，GDD由酪氨酸領(lǐng)頭定位在疏水氨基酸的延伸處。（Y）GDD周圍的序列在復(fù)制階段相同的每組病毒中具有同源性。復(fù)制過(guò)程中來(lái)源于不同正鏈和負(fù)鏈病毒的RNA聚合酶，即使在最保守的GDD區(qū)也有差異。分段負(fù)鏈病毒的保守序列是SDD，而非分段的負(fù)鏈病毒的則是GDN(Q)。雙股病毒的保守序列更接近于正鏈病毒，被修改成（Y）MDD[27]。

Poch等認(rèn)為RNA聚合酶由四個(gè)主要的區(qū)域組成：A區(qū)D*****D為酸性區(qū)，B區(qū)G***T***(N/E)(S/T)是核苷酸結(jié)合的核心區(qū)，C區(qū)（Y）GDD是催化功能核心區(qū)，D區(qū)LKR為堿性區(qū)。這些區(qū)域經(jīng)常被易變的絞鏈 (hinges)結(jié)構(gòu)有規(guī)則地分隔并聯(lián)成一個(gè)連鎖區(qū)域[28]。人免疫缺損病毒(HIV)Ⅰ型反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)中，保守的（Y）GDD區(qū)存在于酶活性中心的β發(fā)夾中[29]。Inokuchi等假定這個(gè)區(qū)參與了金屬離子結(jié)合于酶催化位置的過(guò)程，這在θβ和脊髓灰質(zhì)炎病毒的RNA聚合酶中得到了證實(shí)。這個(gè)區(qū)域突變能導(dǎo)致酶活性喪失。某些病毒RNA聚合酶該區(qū)域的一兩個(gè)位置上含有不同的氨基酸殘基，如：（Y）GDD的酪氨酸在細(xì)小核糖核酸病毒的RNA聚合酶中是嚴(yán)格保守的，但在黃病毒中則是易變的。用蛋氨酸取代脊髓灰質(zhì)炎病毒的（Y）GDD區(qū)的酪氨酸則導(dǎo)致功能喪失的突變，這種突變也能被分子內(nèi)二次突變所抑制。半胱氨酸在TMV、蛋氨酸在南方菜豆花葉病毒(SBMV)，絲氨酸在黃熱病毒(YFV)、BMV和AMV的保守區(qū)中發(fā)現(xiàn)，這個(gè)區(qū)域氨基酸的改變，可能被其它地方同樣分子的二次突變所抑制。有兩個(gè)非常保守的區(qū)域和嘌呤三核苷酸的結(jié)合活性相關(guān)，A區(qū)(G/A****GKS/T)和位于A區(qū)下游約20～40個(gè)氨基酸處的B區(qū)(DEAD)。B區(qū)與依賴RNA或DNA的NTP酶活性關(guān)聯(lián)的MG NTP復(fù)合體中的MG離子相互作用。兩種DNA螺旋酶參與了復(fù)制、重組和DNA修復(fù)。

有人將脊髓灰質(zhì)炎病毒3D聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)與其他的聚合酶做比較并得出一些結(jié)論。首先，脊髓灰質(zhì)炎病毒聚合酶的總體結(jié)構(gòu)也好象一只右手，這與DDRPS、RTS和DDDPS相一致。其“手掌”亞結(jié)構(gòu)域與其他三種聚合酶中觀察到的“手掌”極為相似。這個(gè)“手掌”結(jié)構(gòu)域里含有在所有種類的聚合酶中都存在的四氨基酸序列基序：A、B、C和D，除此之外，還有第五個(gè)基序E，基序E是RDRPS和RTS所特有的。“大拇指”結(jié)構(gòu)域主要由α-螺旋組成，不過(guò)，它和DDRPS、HIV RT或者T7 RPO的“大拇指”的結(jié)構(gòu)并不相似?！笆种浮眮喗Y(jié)構(gòu)域的大部分在這些晶體中都是不規(guī)律的，而其指關(guān)節(jié)以下的可見部分在結(jié)構(gòu)上與其他種類的聚合酶也不相同。其次，脊髓灰質(zhì)炎病毒的晶體結(jié)構(gòu)也支持“二金屬離子”的催化機(jī)制：保守的天冬氨酸為進(jìn)行催化反應(yīng)處于合適的位置上。

除了“手指”、“手掌”和“大拇指”亞結(jié)構(gòu)域以外，脊髓灰質(zhì)炎病毒聚合酶還包括一個(gè)獨(dú)特的手指N-末端區(qū)，這在其他種類的聚合酶中并未觀察到（圖B）。這個(gè)區(qū)域可能在聚合酶的寡聚反應(yīng)中起到一定作用。

為了更深入地了解其他病毒的RDRPS，人們將許多RDRPS的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)與在脊髓灰質(zhì)炎病毒晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的那些結(jié)構(gòu)相比較。二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)稱為PHD法（來(lái)自For Predict at Heidelberg），由Rost和Sander的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法產(chǎn)生。Burkhard Rost 的蛋白預(yù)測(cè)服務(wù)器的網(wǎng)址目前是：http://WWW.emblheidelberg.de/services/sander/predictprotein/pphelptoc.html.PHD法使用一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)經(jīng)過(guò)了130多個(gè)已知晶體結(jié)構(gòu)的晶體化的蛋白質(zhì)分子鏈的錘煉。為了得到更為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，程序使用的是序列的一系列線性排列，而非單一的序列。為了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，科學(xué)家們用程序來(lái)預(yù)測(cè)100多個(gè)已知的但程序并不熟悉的蛋白的結(jié)構(gòu)。結(jié)果是，如果在預(yù)測(cè)中使用了合理的序列排列，PHD法對(duì)于球形蛋白的準(zhǔn)確率可以達(dá)到70%以上。最佳的序列排列不含有多余的信息且序列一致性在90%到30%之間。許多聚合酶的或者許多RNA病毒家族公認(rèn)的聚合酶蛋白的序列已經(jīng)得到分析。在幾種RNA依賴的RNA聚合酶中存在著許多變異?，F(xiàn)在，結(jié)構(gòu)方面的知識(shí)已經(jīng)可以解釋許多變異造成的影響。

依賴RNA的RNA聚合酶是特殊的復(fù)合物，不僅作為RNA復(fù)制酶，而且也作為轉(zhuǎn)錄酶。不僅催化RNA的聚合，而且也進(jìn)行RNA的修飾。關(guān)于依賴于RNA的RNA聚合酶的研究是目前RNA病毒分子生物學(xué)研究非?；钴S的領(lǐng)域，對(duì)它的深入研究將繼續(xù)朝著兩個(gè)方向發(fā)展：一是參與每一反應(yīng)的功能區(qū)域的圖譜分析；二是探索復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶之間內(nèi)部轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，它們必將成為人類最終攻克RNA病毒的有力武器。

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(收稿日期：2009.03.10)