[摘要] 目的 分析梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(TPELISA)雙抗原夾心一步法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體中出現(xiàn)的鉤狀效應(yīng)，探討其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響以及避免措施。 方法 TPELISA雙抗原夾心一步法檢測(cè)結(jié)果為陰性的10份可疑標(biāo)本，分別用雙抗夾心二步法、稀釋法和梅毒特異性抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)進(jìn)行梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)。結(jié)果 10份用TPELISA雙抗原夾心一步法檢測(cè)結(jié)果為陰性的可疑標(biāo)本，用雙抗原夾心二步法檢測(cè)時(shí)結(jié)果全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性;TPPA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性而且效價(jià)均大于1∶1280;標(biāo)本經(jīng)倍比稀釋后，分別采用TPELISA雙抗原夾心一步法和二步法進(jìn)行測(cè)定，用一步法在1∶2和1∶4時(shí)分別有4例和2例測(cè)定結(jié)果仍為陰性，稀釋度在1∶512范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性; TPELISA一步法測(cè)定結(jié)果的吸光度隨著血清稀釋倍數(shù)的增加，吸光度值逐漸增加達(dá)高峰，后吸光度逐漸減小，曲線呈“鐘形”;二步法則曲線在開(kāi)始的時(shí)候維持在高值并無(wú)太大變化，而后隨稀釋倍數(shù)增加吸光度值逐漸下降，曲線呈倒“S形”。結(jié)論 TPELISA一步法在檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體中存在“鉤狀效應(yīng)”，用稀釋法或者兩步法可以避免該效應(yīng)。 

[關(guān)鍵詞] 梅毒螺旋體;鉤狀效應(yīng);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 

文章編號(hào):1003-1383(2009)04-0421-03

中圖分類號(hào):R 446.61

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.04.023

梅毒是由梅毒螺旋體(TP)感染引起的疾病，以性傳播為主，也可以通過(guò)血液及母嬰等形式傳播。因此，對(duì)獻(xiàn)血員、產(chǎn)婦、輸血患者進(jìn)行梅毒螺旋體感染的實(shí)驗(yàn)室檢查具有非常重要的意義。我們選取10份臨床可疑標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，就TP

ELISA中的“鉤狀效應(yīng)”產(chǎn)生的原因和避免措施進(jìn)行探討。

材料和方法

1.血清標(biāo)本來(lái)源本院住院和門診病人中臨床癥狀和病史疑似梅毒，血清TPELISA一步法檢測(cè)陰性，TPPA試驗(yàn)檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本10例。

2.試劑和儀器 TPELISA梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒為上?？迫A生物工程公司生產(chǎn)，TPPA試劑盒由日本富士瑞必歐株式會(huì)社提供。酶標(biāo)儀和洗板機(jī)為雷杜公司的RT6000型和RT3000型。

3.方法 用TPELISA雙抗原夾心一步法和二步法分別對(duì)樣本的原液及稀釋液進(jìn)行檢測(cè)。一步法按試劑盒說(shuō)明書操作;二步法用一步法試劑先加血清樣本，37℃孵育30分鐘，洗板，再加酶標(biāo)抗體。TPPA檢測(cè)步驟按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

結(jié)果

1.用雙抗原夾心一步法檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體陰性的10份可疑標(biāo)本，用二步法檢測(cè)，結(jié)果轉(zhuǎn)為陽(yáng)性;用TPPA檢測(cè)也均為陽(yáng)性，而且其效價(jià)均大于1∶1280，見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法對(duì)樣本的檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本號(hào)TPELISA一步法OD值結(jié)果

TPELISA兩步法OD值結(jié)果TPPA

10.056- 0.122+1∶1280

20.034- 0.290+ 1∶1280

30.028- 0.322+1∶2560

40.043- 0.117+1∶2560

50.021- 0.671+1∶1280

60.045- 0.338+1∶5120

70.026- 1.147+1∶1280

80.024- 0.416+1∶1280

90.063- 0.134+1∶2560

100.064- 0.734+1∶2560

注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:陽(yáng)性;“-”:陰性

2.分別用雙抗原夾心一步法和二步法測(cè)定10份經(jīng)過(guò)1∶2，1∶4…… 1∶2048倍比稀釋的標(biāo)本，10份標(biāo)本各稀釋度的吸光度(A)的均值見(jiàn)表2。兩種方法測(cè)定的吸光度值與血清抗體濃度的關(guān)系見(jiàn)圖1。用雙抗原夾心一步法測(cè)定不同稀釋度血清，吸光度值隨著稀釋倍數(shù)的增加逐漸升高，達(dá)到較高水平后又逐漸下降，曲線變化呈“鐘形”;二步法則吸光度值開(kāi)始維持在高值并無(wú)太大變化，而后隨稀釋度增加而逐漸下降，曲線呈倒“S”形。

3.TPELISA一步法和二步法對(duì)不同稀釋度血清的抗體檢出情況比較 一步法的漏檢率呈兩極現(xiàn)象。見(jiàn)表3。

表2 TPELISA一步法和二步法檢測(cè)不同稀釋度血清的吸光度均值

稀釋度TPELISA一步法OD值結(jié)果

TPELISA二步法OD值結(jié)果

1∶20.012- 1.866+

1∶40.290+ 1.810+

1∶80.690+ 1.712+

1∶161.396+ 1.654+

1∶321.805+ 1.702+

1∶641.528+ 1.523+

1∶1281.151+ 0.789+

1∶2560.984+ 0.671+

1∶5120.416+ 0.447+

1∶10240.134+ 0.134+

1∶20480.077- 0.124+

注:一步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;二步法cutoff = 2.1×0.05=0.106;“+”:陽(yáng)性;“-”:陰性

圖1 TPELISA雙抗原一步法和二步法檢測(cè)不同稀釋度血清的吸光度值變化曲線

表3 一步法和二步法對(duì)不同稀釋度標(biāo)本的檢出情況

稀釋倍數(shù)一步法陽(yáng)性(N)陰性(N)

二步法陽(yáng)性(N)陰性(N)一步法漏檢率(%)

1∶1010 100100

1∶264 10040

1∶482 10020

1∶8100 1000

1∶16100 1000

1∶32100 1000

1∶64100 1000

1∶128100 1000

1∶256100 1000

1∶512100 1000

1∶102473 9130

1∶204864 8244

討論

目前，針對(duì)梅毒的血清學(xué)檢查主要包括TP特異性和非特異性抗體檢測(cè)。梅毒非特異性抗體檢測(cè)包括快速血清反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)和(TRUST)等;而對(duì)特異性抗體檢測(cè)方法有:梅毒螺旋體血球凝集實(shí)驗(yàn)(TPHA)，TPPA，免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)，熒光密螺旋體抗體吸附實(shí)驗(yàn)(FTAABS)及TPELISA等。TPPA，TPHA，免疫印跡，F(xiàn)TAABS雖然特異性很強(qiáng)，但因?yàn)槌杀据^高，操作步驟煩瑣而不適合對(duì)于大批量標(biāo)本的檢測(cè)。而ELISA法具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、靈敏度高和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而普遍被各醫(yī)療機(jī)構(gòu)衛(wèi)生防疫部門以及血液中心采用，作為大批量標(biāo)本梅毒抗體的篩查方法。TPELISA是利用基因工程合成的梅毒抗原，通過(guò)雙抗原夾心法檢測(cè)梅毒特異性抗體[1]，主要包括TPELISA雙抗原夾心一步法和二步法。TPELISA一步法因其具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、結(jié)果易于判斷及易于進(jìn)行質(zhì)量控制等優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用，逐漸取代了RPR，成為醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和血站的梅毒篩選方法。但是，由于TPELISA一步法檢測(cè)技術(shù)中“鉤狀效應(yīng)”的存在，可以引起檢測(cè)結(jié)果假陰性。因此，如何避免“鉤狀效應(yīng)”，減少陽(yáng)性病例的漏診率成為目前研究的重點(diǎn)。

TPELISA法檢測(cè)梅毒特異性抗體的方法主要包括:雙抗原夾心法和間接法。雙抗原夾心法主要檢測(cè)梅毒特異性抗體IgG和IgM總抗體。雙抗原夾心一步法測(cè)定梅毒特異性抗體是最常用的方法。其原理是在同一個(gè)ELISA檢測(cè)體系中同時(shí)加入待測(cè)標(biāo)本(含抗體)和酶標(biāo)記抗原，形成的結(jié)合物包括:固相抗原+待測(cè)抗體(A)， 固相抗原+待測(cè)抗體+酶標(biāo)抗原(B)，待測(cè)抗體+酶標(biāo)抗原(C)，酶標(biāo)抗原+待測(cè)抗體+酶標(biāo)抗原(D)，在這4種結(jié)合物中，只有(B)結(jié)合物才是要測(cè)定的目的結(jié)合物。如果在反應(yīng)體系中，待測(cè)的抗體濃度太高，由于競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，(C)和(D)類結(jié)合物增多，(B)類結(jié)合物減少，導(dǎo)致反應(yīng)顯色降低，甚至不顯色，這就是所謂的“鉤狀效應(yīng)”[2]。

在本研究中，通過(guò)采用TPELISA雙抗原夾心一步法、二步法及TPPA檢測(cè)10份可疑標(biāo)本，結(jié)果表明，用雙抗原夾心一步法檢測(cè)為陰性的這10份標(biāo)本，用二步法檢測(cè)均轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，TPPA檢測(cè)結(jié)果也均為陽(yáng)性，而且滴度均達(dá)到1∶1280以上;將10份標(biāo)本再進(jìn)行倍比稀釋并同時(shí)用雙抗原夾心一步法和二步法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，稀釋度在1∶2和1∶4時(shí)，一步法檢分別有4例和2例檢測(cè)結(jié)果仍為陰性，其余稀釋度血清用雙抗原夾心一步法和二步法檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，這說(shuō)明了雙抗原夾心一步法對(duì)高濃度抗體標(biāo)本的檢測(cè)是存在鉤狀效應(yīng)的，而將存在鉤狀效應(yīng)的標(biāo)本經(jīng)過(guò)稀釋后可以消除，但是稀釋的倍數(shù)要達(dá)到一定程度。通過(guò)對(duì)10份標(biāo)本進(jìn)行倍比稀釋度后，用雙抗原夾心一步法和二步法檢測(cè)，用各濃度血清吸光度值(A)的均值與血清稀釋度關(guān)系所做的曲線可看出，一步法在原倍及低稀釋倍數(shù)也就是標(biāo)本中待測(cè)抗體濃度較高時(shí)，吸光度值低;隨著稀釋倍數(shù)的增加吸光度值反而逐漸增高，到最適比時(shí)達(dá)到最高值，而后又逐漸降低，吸光度(A)值變化曲線呈“鐘形”。而用二步法檢測(cè)，吸光度(A)一直維持在較高水平，而當(dāng)稀釋度達(dá)一定倍數(shù)時(shí)，吸光度(A)值才逐漸下降，整個(gè)曲線呈倒的“S”形，這與蔣玉蓮，朱浩穩(wěn)等的報(bào)道相似[3]。

雙抗原夾心二步法由于是抗體和酶標(biāo)抗原分兩步加入，因此不存在競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，可以避免鉤狀效應(yīng)的產(chǎn)生。在本研究中，我們利用一步法試劑，先加入血清標(biāo)本，37℃孵育30分鐘，洗板后再加入酶標(biāo)抗原，這樣建立起來(lái)的二步法測(cè)定經(jīng)一步法檢測(cè)結(jié)果為陰性，而TPPA法檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本，其結(jié)果全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，這說(shuō)明了雙抗原夾心二步法可以避免鉤狀效應(yīng)的產(chǎn)生。雖然二步法可以避免鉤狀效應(yīng)的產(chǎn)生，但卻造成實(shí)驗(yàn)的敏感性降低[4]，一些弱陽(yáng)性標(biāo)本會(huì)被漏檢。

雖然雙抗原夾心一步法在方法學(xué)上存在“鉤狀效應(yīng)”的缺陷，但是由于其快速簡(jiǎn)便節(jié)約時(shí)間的優(yōu)勢(shì)，在我國(guó)仍然占據(jù)著很大的市場(chǎng)。為避免和消除鉤狀效應(yīng)，我們可以用二步法、稀釋法及TPPA或RPR 等方法做為補(bǔ)充，對(duì)臨床一些可疑標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定[5]。同時(shí)對(duì)于試劑廠家，應(yīng)在固相和標(biāo)記抗體或抗原的選擇匹配上，采取結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離或含多個(gè)可結(jié)合位點(diǎn)的方法，這樣在很大程度上，可以避免或減輕“鉤狀效應(yīng)”;另外也可充分混勻反應(yīng)液，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)溫育時(shí)間，則可使A、C和D復(fù)合物減少至最低程度，而減輕“鉤狀效應(yīng)”的產(chǎn)生。 

總之，本研究結(jié)果表明，TPELISA一步法檢測(cè)梅毒特異性抗體存在鉤狀效應(yīng)，在出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果和患者病史及臨床病表變現(xiàn)不一致的情況下，應(yīng)該選擇其他方法進(jìn)行確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期:2009-05-01 修回日期:2009-07-31)

(編輯:梁明佩)