蒙華琳　曹　濤

摘 要：目的：探討附子對甲狀腺素大鼠主動脈血管細(xì)胞外基質(zhì)的影響。方法：按Woessn方法測定大鼠心肌和主動脈組織中羥脯氨酸含量，用酶譜分析半定量法分析MMP2活性。結(jié)果：①模型組大鼠心肌和主動脈膠原含量與正常對照組比較均明顯升高（P<0.05）；附子給藥組和粉防己堿給藥組與模型組相比明顯降低（P<0.05），與正常對照組比較沒有顯著差異（P>0.05）；②模型組主動脈MMP₂活性與正常對照組相比明顯下降（P<0.05）；附子給藥組、粉防己堿給藥組與模型組比較MMP₂活性略有上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），仍然不能恢復(fù)到正常水平；而心肌中MMP₂條帶較弱以至于不能分析。結(jié)論：附子抑制膠原合成但不能改變該模型大鼠主動脈血管MMP₂活性，說明附子預(yù)防心血管肥厚的機(jī)制與抑制其膠原合成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：L-甲狀腺素；L-羥脯氨酸；基質(zhì)金屬蛋白酶；心血管功能；附子

中圖分類號：R-332文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2009）02-0032-02

通常認(rèn)為心血管肥厚是心肌細(xì)胞的肥大和主動脈血管中層平滑肌細(xì)胞的增生，同時伴有組分的重排和細(xì)胞外基質(zhì)的聚集和纖維化［1］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)在心血管肥厚的形成中起著重要的作用。對臨床高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠的研究表明，主動脈血管壁膠原（細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分）生成和沉積增多是主動脈血管壁肥厚的重要原因之一［2］。在正常情況下，心血管組織中膠原合成水平和分解水平保持平衡，當(dāng)合成大于分解水平時細(xì)胞外基質(zhì)含量增多。附子作為傳統(tǒng)的溫陽圣藥，在許多治療心血管肥厚的方劑中作為主藥使用。本研究通過測定膠原L-羥脯氨酸含量及細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP₂）的活性（體內(nèi)降解膠原的主要蛋白酶）來分析膠原的分解水平，探討附子對細(xì)胞外基質(zhì)的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

取適量L-甲狀腺素（L-Thy，Sigma公司），加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），配成質(zhì)量濃度為1g/L的混懸液備用。自制附子水煎液，濃度為含生藥2.7g/mL；粉防己堿（南寧植物原料藥廠，純度98.5%）；其它試劑均為市售，分析純。

1.2 動物模型及分組

雄性SD大鼠（由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），80只，體重220~240g。除對正常對照組頸背部皮下注射0.5%CMC-Na外，其余動物頸背部皮下注射L-Thy 4mg/（kg?d-1），造成心肌肥厚模型。造模后1周測尾血壓，根據(jù)血壓值將造模動物隨機(jī)分為4組（每組大鼠20只）：模型組、附子給藥組、粉防己堿給藥組和正常對照組。1周后開始灌胃給藥，按附子1mL/100g給藥，粉防己堿50mg/kg，其余兩組用雙蒸水灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。

1.3 組織膠原含量測定

按Woessn的方法［3］，將主動脈血管、心臟稱重，剪碎，加丙酮-乙醚（1∶1體積）混合液放置過夜，吸去上清液，晾干，110℃烤至恒重。心臟取樣5～10mg、主動脈血管取樣3～4mg，加6M HCI 1 mL，105℃水解24h，調(diào)至pH6.0，準(zhǔn)確調(diào)整體積至5mL。3500rpm離心10min。取上清液0.5mL用UV754分光光度計γ560nm測定羥脯氨酸含量。

1.4 MMP2活性測定

采用酶譜法［3］測定心肌和主動脈血管MMP2活性。將蛋白溶液混合在5×樣品緩沖液中，SDS-PAGE電泳，37℃孵育過夜，考馬斯亮蘭G25O染色，脫色。陰性對照的孵育液中加入EDTA10mmol?L-1，作為基質(zhì)蛋白酶的抑制劑，結(jié)果未見相應(yīng)的降解條帶。數(shù)據(jù)用Bandscan4.0軟件分析處理：條帶酶解量=條帶面積/（條帶灰度-背景灰度）；MMP2比活=酶解量/樣品蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有參數(shù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），兩組比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 附子對甲狀腺素模型大鼠心肌和主動脈血管膠原含量的影響

本實驗以甲狀腺素大鼠為模型，測量心肌和主動脈血管膠原L-羥脯氨酸含量以反映該組織膠原含量。結(jié)果顯示：模型組大鼠心肌和主動脈血管膠原含量與正常對照組相比，均有明顯升高（P<0.05）。附子給藥組和粉防己堿給藥組與模型組相比，心肌和主動脈血管膠原含量有明顯降低（P<0.05），與正常對照組比較沒有顯著性差異（P>0.05），說明附子和粉防己堿具有抑制心血管組織膠原含量的作用。見表1。

2.2 附子對甲狀腺素模型大鼠心肌和主動脈血管MMP2活性影響

本實驗以測定甲狀腺素大鼠心肌和主動脈血管組織MMP2活性，反映組織膠原蛋白的分解水平。結(jié)果顯示：模型組主動脈MMP2活性與正常對照組相比明顯下降（P<0.05）；附子給藥組、粉防己堿給藥組分別與模型組比較，MMP2活性略有上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），仍然不能恢復(fù)到正常水平；而心肌中MMP2條帶較弱以至于不能分析。見表2。

3 討論

心肌和主動脈血管間質(zhì)主要由膠原纖維和糖蛋白組成。而膠原纖維主要由心肌間質(zhì)的成纖維細(xì)胞和主動脈血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的I和Ⅲ型膠原組成，I型膠原占總數(shù)的80%～85%，Ⅲ型占11%。前者聚合成粗纖維，后者聚合成細(xì)纖維，編織成纖維網(wǎng)絡(luò)，維持心肌和主動脈血管的結(jié)構(gòu)和功能的完整。膠原除了作為支撐材料外，還可以影響組織形態(tài)。膠原的沉積既是高血壓心血管重構(gòu)的結(jié)果，又是促進(jìn)其進(jìn)一步重構(gòu)的誘因。正常心血管間質(zhì)膠原處于不斷地分泌和降解的平衡狀態(tài)，一旦平衡失調(diào)，便造成病理狀態(tài)。間質(zhì)膠原生成過多或者分解過少都將引起膠原堆積以致細(xì)胞外基質(zhì)含量增多，這是導(dǎo)致心血管重構(gòu)的重要原因［1］。

本研究以甲狀腺素大鼠為模型，測量心肌和主動脈血管L-羥脯氛酸含量以反映該組織膠原含量。因為L-羥脯氨酸是膠原中特有的氨基酸，其含量約占膠原中所有氨基酸的13.4%，由于其在其他蛋白質(zhì)中的含量極低，組織中L-羥脯氨酸量的高低可反映該組織膠原含量的大小。本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素造模后4周心肌和主動脈壁膠原含量明顯增高，說明膠原含量的增高是導(dǎo)致心血管肥厚的重要原因之一。

除了膠原的合成外，膠原的分解主要依靠膠原降解酶-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）來完成［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），是體內(nèi)降解膠原的主要蛋白酶，血管主要有MMP₂（72KU）、MMP₉（92KU）等。MMPs在機(jī)體內(nèi)主要以非活性的酶原形式存在。非活性狀態(tài)MMPs可被胰蛋白酶、中性蛋白酶和汞劑等激活為62Ku MMPs。本研究采用酶譜半定量測定法［4］分析MMP₂活性。此方法可以分離不同的MMPs以及將組織中與MMPs緊密結(jié)合的組織抑制劑MMPs分離，又可直接顯示其活性條帶。從研究結(jié)果看出，造模4周主動脈中MMP₂活性降低，可能與組織血管緊張素Ⅱ含量上升，抑制MMP₂有關(guān)［5］。作為鈣通道阻斷劑，粉防己堿可升高M(jìn)MP₂活性，加快對膠原的降解，是其抑制血管重構(gòu)的機(jī)制之一。而附子對MMP₂活性無明顯影響，推測一方面由于AP-1是許多MMPs基因啟動子結(jié)合位點［6］，作為AP-1抑制劑的附子，參與調(diào)節(jié)該酶的活性過程，可阻斷MMP₂的基因表達(dá)，并抑制MMP₂的活性［4］；另一方面，附子抑制溶酶體酶的釋放，而后者激活MMPs，所以附子可部分降低合成好的膠原的降解速度［7］。也可能是用藥時間尚未到達(dá)逆轉(zhuǎn)的程度。其確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。心肌中MMP₁是主要降解膠原的酶，一般以酶原形式存在且活性極低。該酶激活后使三股旋轉(zhuǎn)的膠原肽鏈展開，從而促使其它膠原酶如MMP₂，MMP₉進(jìn)一步分解膠原纖維［8］。使心肌中的MMP₂活性極低以至于無法分析。因此，附子抑制膠原合成但不能改變該模型大鼠主動脈血管MM₂活性，說明附子預(yù)防心血管肥厚的機(jī)制與抑制其膠原合成有關(guān)。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）