王曉南　王麗環(huán)　高　鵬

摘 要：動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基相比天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基等傳統(tǒng)培養(yǎng)基有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，其組成成分相對(duì)清楚，制備過程簡(jiǎn)單，日益得到生物技術(shù)界的重視。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，可科學(xué)有效地考察細(xì)胞培養(yǎng)基中多因素、多水平間的交互作用。應(yīng)用新型蛋白質(zhì)組分分析技術(shù)及生物芯片技術(shù)定位胞漿信號(hào)通路相關(guān)蛋白、膜表面的生長(zhǎng)因子受體、激素受體、細(xì)胞因子受體、粘附分子等，用以確定細(xì)胞培養(yǎng)基中調(diào)控分子的添加組合。對(duì)無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)及常用的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行概述。以期為動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究與研制提供參考。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物細(xì)胞；無血清培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：R-332文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）02-0021-03

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域中的前沿研究課題之一，無論是在基礎(chǔ)研究還是生產(chǎn)實(shí)踐方面都得到生物技術(shù)界的重視。隨著哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大和生物藥物需求的增長(zhǎng)，基于細(xì)胞及產(chǎn)品特性的無血清培養(yǎng)基的研制已成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要課題。無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究日益得到人們的重視。近年來，有關(guān)無血清培養(yǎng)基的研制和開發(fā)得到了迅速發(fā)展，推動(dòng)了基因工程產(chǎn)品及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)及分類

細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞體外培養(yǎng)的最重要因素。無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基是一種不含有動(dòng)物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)、繁殖的一種培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基由于其組成成分相對(duì)清楚，制備過程簡(jiǎn)單，在現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。無血清培養(yǎng)技術(shù)也是闡明細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究問題的有力工具。

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的血清或組織提取物，其中最常用于培養(yǎng)基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在以下缺點(diǎn)：

（1）血清來自于動(dòng)物體，其對(duì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)的主要作用是提供生長(zhǎng)因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用，但同時(shí)也有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子和毒性因子，所以存在潛在毒性。

（2）由于動(dòng)物血清提取的局限，使其應(yīng)用于培養(yǎng)基的價(jià)格格外昂貴。

（3）動(dòng)物血清提取的局限，也給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來困難，同時(shí)也存在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化難的問題，具有潛在的細(xì)胞毒性作用，給規(guī)模化培養(yǎng)細(xì)胞增加了難度［1］。

由于上述常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在的諸多問題，促使我們改進(jìn)培養(yǎng)方法，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基來替代。細(xì)胞工程中無血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，在很大程度上可以避免含血清培養(yǎng)所帶來的不利。無血清培養(yǎng)基具有以下明顯的優(yōu)缺點(diǎn)：

無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn):

（1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

（2）避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。

（3）避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。

（4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。

（5）可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。

缺點(diǎn)：

（1）細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。

（2）成本較高。

（3）針對(duì)性很強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。

發(fā)展無血清培養(yǎng)基，除了開發(fā)化學(xué)合成培養(yǎng)基外，也可以尋找適當(dāng)?shù)木哂蓄愃朴谘骞δ艿纳锓肿觼硖娲?。目前，無血清培養(yǎng)基的研究有兩個(gè)方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動(dòng)物來源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添加組分。依次可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無血清培養(yǎng)基歸納為以下4種：

（1）無血清培養(yǎng)基。此為一般意義上的無血清培養(yǎng)基，是由各類可替代血清功能的生物材料配制成的細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白（BSA）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高，添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動(dòng)物來源蛋白［2］。

（2）無動(dòng)物來源培養(yǎng)基。許多商業(yè)公司開發(fā)的無動(dòng)物來源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無動(dòng)物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的需要。

（3）無動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基。培養(yǎng)基完全不用動(dòng)物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對(duì)穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞是高度特異性的［3］。

（4）化學(xué)組分限定培養(yǎng)基［4，5］。此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所添加的少量動(dòng)物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝研究，同時(shí)分離純化也比較方便。

2 無血清培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)研究

無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用，而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。

2.1 無血清培養(yǎng)基的基本配方

基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)或兼性貼壁生長(zhǎng)；而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長(zhǎng)。

2.2 添加組分

2.2.1 促貼壁物質(zhì)

許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

2.2.2 促生長(zhǎng)因子及激素

針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。

2.2.3 酶抑制劑

培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中酶抑制劑必不可少，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。

2.2.4 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

2.2.5 微量元素

硒是最常見的微量元素。

2.3 使用方法

目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%、1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵是使所培養(yǎng)細(xì)胞處于如下狀況：

（1）處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；

（2）>90%活細(xì)胞率；

（3）適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種。

細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法：

直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10⁵-3.5×10⁵細(xì)胞/mL。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶-3×10⁶細(xì)胞/mL時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4~7天后達(dá)到2×10⁶~4×10⁶細(xì)胞/mL時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/mL，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

(1)以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基-25％SFM混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

（2）當(dāng)細(xì)胞密度>5×10⁵細(xì)胞/mL時(shí)，以2×10⁵~3×10⁵細(xì)胞/mL細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（3）以2×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75%SFM中傳代培養(yǎng)。

（4）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/mL（接種后4~6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（5）每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/mL，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，最好不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：從1∶2到1∶4再到1∶16直至100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2~3次。

培養(yǎng)直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，允許進(jìn)行2~3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)3次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基缺乏血清中天然成分未中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

3 結(jié)語

動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究方法運(yùn)用了基因組技術(shù)、蛋白質(zhì)組技術(shù)、代謝工程技術(shù)、計(jì)量分析方法等。另外，有關(guān)無血清培養(yǎng)基在線數(shù)據(jù)庫的建立也方便了相關(guān)信息的檢索與分析［6］，為無血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)提供了更多的信息。

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大，將會(huì)有更多的科學(xué)方法運(yùn)用到細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與研究中［7］。新一代動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基將具有“無血清、無蛋白、無動(dòng)物來源、成分確定”的特性，同時(shí)在功能上屬于安全、通用的高效培養(yǎng)基，這種細(xì)胞無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞工程領(lǐng)域中將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）