鄒珍友　黃　艷　王　勇　張　慧　戴　威　許露露　程彥偉　汪素美

摘要為了解趨化性細(xì)胞逆趨化劑濃度梯度遷移的機(jī)理，用帶有熒光標(biāo)記的趨化劑(FITC-LPS)誘導(dǎo)了培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在靠近趨化劑的一側(cè)的熒光比背離趨化劑一側(cè)的熒光強(qiáng)，并朝趨化劑方向長出偽足移動。細(xì)胞在迎、背趨化劑兩面與趨化劑結(jié)合濃度的差異導(dǎo)致細(xì)胞微絲組裝的部位差異可能是造成偽足生長密度差異的原因，這一差異決定了細(xì)胞趨化運(yùn)動的方向。

關(guān)鍵詞中性粒細(xì)胞；趨化劑；偽足

中圖分類號Q813.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)01-0268-01

趨化性是細(xì)胞朝可溶性化學(xué)刺激物移動的一種現(xiàn)象。一些真核細(xì)胞，如白細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等在體內(nèi)均有明顯的趨化現(xiàn)象，趨化運(yùn)動時細(xì)胞可在體表任何部位形成臨時性的細(xì)胞質(zhì)突起(偽足) 作為運(yùn)動器而移動[1，2]。

中性粒細(xì)胞在體內(nèi)受細(xì)菌感染時，細(xì)菌表面的內(nèi)毒素即脂多糖可成為一種趨化劑，使中性粒細(xì)胞發(fā)生趨化變形穿出毛細(xì)血管集聚到細(xì)菌侵犯的部位，吞噬細(xì)菌細(xì)胞，在胞質(zhì)內(nèi)形成吞噬體。再被各種水解酶、過氧化物酶、溶菌酶及其他具有殺菌作用的蛋白質(zhì)、多肽等成分殺死并分解消化[3-5]。

對于細(xì)胞趨化運(yùn)動的啟動，細(xì)胞逆趨化劑濃度梯度運(yùn)動的機(jī)理，目前了解的不是很清楚，為此筆者用標(biāo)有熒光劑的趨化劑LPS誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動，顯示趨化劑在細(xì)胞迎、背趨化劑面與趨化劑結(jié)合濃度的差異，以及細(xì)胞在兩面生成偽足的大小、密度不同，觀察這些差異與細(xì)胞向趨化劑方位移動的關(guān)系。

1材料與方法

1.1試驗材料

小鼠6只，購自南京醫(yī)科大學(xué)；PVP，南京阿恩地公司生產(chǎn)；復(fù)方泛影葡氨、肝素，廣州治藥廠生產(chǎn)；脂多糖L2880、異硫氫酸熒光素，美國Sigma公司生產(chǎn)。

1.2大腸桿菌培養(yǎng)與提取LPS

無菌條件下，接種大腸桿菌于LB培養(yǎng)基中，置搖床37℃過夜培養(yǎng)。從搖床上取出菌液，3 000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用10mL蒸餾水混勻，置65～68℃水浴，加入等體積預(yù)溫的苯酚，激烈攪勻，加熱5min，冰浴，迅速降溫至10℃以下。3 000rpm離心30min，取上清液，透析除酚并濃縮，20 000rpm超速離心10min，取上層透明膠狀部分，懸浮于水中，冷凍干燥得到粉末狀LPS。

1.3抽提小鼠中性粒細(xì)胞與電鏡觀察

取5月齡小鼠，腹腔注射PVP-泛影葡胺溶液2mL后放回籠中過夜，誘導(dǎo)生成中性粒細(xì)胞。向小鼠腹腔注射0.5 mL水合氯醛麻醉后，剪開腹部表皮(注意不要弄破腹腔膜)，吸取腹水，在超凈臺加入Hanks液，2 000rpm離心5min，棄上清液得中性粒細(xì)胞。用2.5％戊二醛將中性粒細(xì)胞混勻，固定10h，用蒸餾水清洗后滴在樣品臺上自然干燥，然后鍍金，放在掃描電鏡下觀察。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞趨化

1.4.1平板打孔趨化試驗。在培養(yǎng)皿中倒上培養(yǎng)基，待冷卻后在中間打一孔加LPS，間距8mm打四周孔，孔內(nèi)加培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞。然后置細(xì)胞培養(yǎng)箱中 5％ CO2 培養(yǎng)5h。最后在倒置顯微鏡下觀察中性粒細(xì)胞向中心孔移動情況。

1.4.2用熒光劑FITC標(biāo)記LPS。將4mg LPS加入0.5％三乙胺2mL內(nèi)，0℃攪拌20min，使LPS雙鏈離解為單鏈結(jié)構(gòu)。用1moL/L的鹽酸10μL將其pH值調(diào)為5，然后加入含5mg FITC的0.1moL/L磷酸鈉溶液1.5mL(pH值9.5)，并在37 ℃下攪拌孵育3h，孵育后，在4℃下將其混合物與磷酸鈉溶液徹底離心后，去上清液即得帶FITC熒光標(biāo)記的LPS。

1.4.3熒光顯微鏡下觀察中性粒細(xì)胞與趨化劑不均勻的結(jié)合。在載玻片上先滴加幾滴1640培養(yǎng)液，加入中性粒細(xì)胞。試驗組的玻片一端加入50μL的熒光標(biāo)記的LPS趨化劑，置CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5h后用濾紙小心沿玻片上的液體吸干，用細(xì)胞培養(yǎng)液小心清洗幾次，切勿將細(xì)胞漂起擾動極性。清洗完畢，吸去玻片上的殘液，置熒光顯微鏡下用綠色濾光片觀察。

2結(jié)果與分析

在顯微鏡下，對照組的中性粒細(xì)胞呈圓形；用無熒光標(biāo)記的趨化劑處理的中性粒細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，有一端有類似片足的結(jié)構(gòu)。FITC-LPS趨化的中性粒細(xì)胞在熒光顯微鏡下可看到大部分細(xì)胞迎趨化劑一端熒光較亮并有較多突起，背趨化劑一端較暗并較圓滑(見圖1、圖2)。

3討論

趨化劑與細(xì)胞表面的受體結(jié)合引起F-actin組裝的信號通路激活，最后通過質(zhì)膜部位的WASP蛋白激活A(yù)rp2/3復(fù)合物，導(dǎo)致肌動蛋白的聚合。本試驗揭示了細(xì)胞逆趨化劑濃度梯度遷移的初步機(jī)理。即趨化劑在擴(kuò)散空間形成的濃度差異，使細(xì)胞不同部位的表面結(jié)合趨化劑數(shù)量有差異，在細(xì)胞迎趨化劑面結(jié)合的趨化劑比背面多，誘導(dǎo)F-actin組裝的信號物質(zhì)激活較多，導(dǎo)致細(xì)胞在趨化劑一面F-actin的聚合比背離趨化劑那面多，結(jié)果使細(xì)胞在靠近趨化劑一面伸出形成大量含微絲的偽足，Myosin-Ⅱ(肌球蛋白)介導(dǎo)的收縮引起細(xì)胞尾部收縮，兩方面的作用和變化最終導(dǎo)致了細(xì)胞逆趨化劑方向產(chǎn)生方向性運(yùn)動[6，7]。

運(yùn)用FITC熒光材料標(biāo)記趨化劑LPS，不僅保留了LPS的活性，同時使LPS帶有熒光，用它誘導(dǎo)培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞趨化性移動，可通過觀察細(xì)胞不同部位的熒光強(qiáng)度，從而判斷中性粒細(xì)胞與趨化劑結(jié)合的方位與細(xì)胞移動方向的關(guān)系。

4參考文獻(xiàn)

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