鐘蘭 劉玉平 彭靜

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，湖北武漢，430065）

植物種質(zhì)資源離體保存技術(shù)研究進(jìn)展

鐘蘭 劉玉平 彭靜

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，湖北武漢，430065）

植物種質(zhì)資源的保存對(duì)于生物多樣性保護(hù)和新品種選育均具有十分重要的意義。綜述了國(guó)內(nèi)外植物種質(zhì)資源離體保存技術(shù)最新研究進(jìn)展，并提出了有待繼續(xù)研究的相關(guān)問(wèn)題。

植物種質(zhì)資源 保存 組織培養(yǎng) 超低溫保存

種質(zhì)資源又稱(chēng)遺傳資源。種質(zhì)系指農(nóng)作物親代傳遞給子代的遺傳物質(zhì)，它往往存在于特定品種之中。如古老的地方品種、新培育的推廣品種、重要的遺傳材料以及野生近緣植物，都屬于種質(zhì)資源的范圍。種質(zhì)資源是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究及植物育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，是保障人類(lèi)良好生存環(huán)境和衣食住行必不可少的財(cái)富，是關(guān)系到一個(gè)國(guó)家和民族競(jìng)爭(zhēng)力的重要戰(zhàn)略物質(zhì)。但隨著人口的發(fā)展，土地的開(kāi)發(fā)，自然環(huán)境的惡化，品種資源的流失日益嚴(yán)重，再加上現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，品種單一化在世界范圍內(nèi)愈演愈烈。因此，植物種質(zhì)資源保存已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)課題。

20世紀(jì)60年代以來(lái)，世界各國(guó)（特別是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家）對(duì)植物種質(zhì)資源的收集和保存工作都加大了投入和研究力度，許多國(guó)家已建立了比較完善的田間基因庫(kù)。但是，田間活體保存占地廣，需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，易受自然災(zāi)害影響。因此，許多科技工作者在尋求更經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、安全的保存方法。

20世紀(jì)50～60年代，植物組織培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)始出現(xiàn)，之后得到不斷完善和發(fā)展。1975年，Henshaw和Morel等首次提出離體保存植物種質(zhì)資源的策略[1]。離體保存以其無(wú)菌培養(yǎng)、占用空間小、勞動(dòng)力和維持開(kāi)支少，易于國(guó)際間交流等特點(diǎn)克服了田間保存的缺點(diǎn)，從而得到了世界各國(guó)的重視[1]。有關(guān)國(guó)際組織和許多國(guó)家相繼建立了植物種質(zhì)離體基因庫(kù)[3]。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)保存種質(zhì)已取得了很好的效果，但是也產(chǎn)生了新的問(wèn)題如頻繁繼代，容易導(dǎo)致體細(xì)胞無(wú)性系變異，從而使保存的原始種質(zhì)丟失。經(jīng)過(guò)許多科學(xué)家的努力，通過(guò)修正組織培養(yǎng)條件，主要是通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基配方、降低培養(yǎng)溫度來(lái)減緩保存材料的生長(zhǎng)；超低溫技術(shù)的運(yùn)用甚至能完全抑制保存材料的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)繼代周期，控制變異的產(chǎn)生，使變異降低到可以接受的最低程度，并已取得重大進(jìn)展。按照保存的技術(shù)手段，植物種質(zhì)資源的離體保存方法可以分為一般保存、緩慢生長(zhǎng)法保存和超低溫保存等。本文就種質(zhì)資源離體保存技術(shù)方面的研究進(jìn)展作一評(píng)述。

1 一般保存

一般保存是在常規(guī)培養(yǎng)條件下對(duì)培養(yǎng)物通過(guò)不斷繼代的方式進(jìn)行保存的方法。目前，多數(shù)植物資源的離體保存仍采用這種方式。采用該方法保存的材料可以隨時(shí)進(jìn)行擴(kuò)繁，因此利用起來(lái)很方便，但由于需要不斷繼代培養(yǎng)，易造成材料的污染、混淆，甚至丟失，并且常會(huì)導(dǎo)致遺傳變異的發(fā)生。

2 緩慢生長(zhǎng)法保存

緩慢生長(zhǎng)法是通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，抑制保存材料的生長(zhǎng)和減少營(yíng)養(yǎng)消耗來(lái)延長(zhǎng)繼代時(shí)間、減少操作和勞力的保存方法。減緩保存材料生長(zhǎng)的具體途徑如下。

2.1 降低培養(yǎng)環(huán)境的氧氣含量

常用的方法是在材料上覆蓋一層礦物油和液體培養(yǎng)基。Caplin離體保存胡蘿卜根的次生韌皮部時(shí)，在保存材料上覆蓋一層重石油，最厚達(dá)38 mm，8個(gè)月后覆有礦物油的材料生長(zhǎng)很少，而且仍是鮮艷的綠色，培養(yǎng)基未見(jiàn)減少，而未覆礦物油的材料變褐，培養(yǎng)基已漸干涸。但Engelmann[3]認(rèn)為，這種方法易使外植體發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，材料恢復(fù)正常培養(yǎng)條件后再生慢，易壞死。減少材料周?chē)难鯕夂康牧硪粭l途徑是降低培養(yǎng)室的大氣壓或改變氣相成分。

2.2 營(yíng)養(yǎng)控制

采用降低培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)也可以減少材料的生長(zhǎng)，以達(dá)到延長(zhǎng)保存時(shí)間的目的。菠蘿試管苗在無(wú)菌水和1/4 MS培養(yǎng)基中保存1 a，存活率分別達(dá)81%和100%，且比保存在完全MS培養(yǎng)基中的試管苗活力強(qiáng)。美國(guó)Hilo國(guó)家無(wú)性系資源圃已采用該技術(shù)進(jìn)行菠蘿種質(zhì)保存。趙密珍等發(fā)現(xiàn)，1/4 MS+ 0.5 mg/L BA+15 g/L蔗糖+12.5 g/L瓊脂是常溫保存草莓試管苗的最適培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中草莓試管苗可保存11～13個(gè)月。鐵皮石斛試管苗在MS，1/2 MS和1/4 MS培養(yǎng)基上保存1 a后，MS培養(yǎng)基保存效果最差，存活率只有41.67%，而1/4 MS和1/2 MS培養(yǎng)基上的存活率分別為91.67%和100%。咖啡分生組織培養(yǎng)的小植株在無(wú)蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上，可保存2.0～2.5 a。

2.3 培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

最常用的生長(zhǎng)抑制劑有脫落酸（ABA）、丁酰井（B9）、多效唑（PP333）和矮壯素（CCC）等。在進(jìn)行獼猴桃離體保存時(shí)，培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L多效唑能夠有效抑制試管苗的生長(zhǎng)，11個(gè)月后存活率為90%。張利平等對(duì)36個(gè)品種葡萄種質(zhì)進(jìn)行了常溫長(zhǎng)期保存。發(fā)現(xiàn)多效唑適用于供試的36個(gè)品種，且多數(shù)基因型的葡萄試管苗已保存2 a，以2.0 mg/kg的濃度為好。研究表明，ABA對(duì)草莓試管苗芽增殖的抑制作用隨ABA使用濃度的增加而明顯增強(qiáng)，且均存在顯著性差異，從常溫保存試管苗的存活率看，以3.0 mg/LABA處理對(duì)草莓試管苗保存效果最為理想，保存到12個(gè)月時(shí)，試管苗的存活率最高，為62.5%，較不使用ABA處理的保存時(shí)間延長(zhǎng)5個(gè)月以上。在紅根草試管苗的保存中,CCC濃度為1.2 mg/L和1.6 mg/L時(shí)，保存360 d時(shí)存活率仍達(dá)90%。王桂蘭等研究指出，200 mg/L B9處理的蘋(píng)果轉(zhuǎn)接苗均因抑制過(guò)度而死亡；100 mg/L B9抑制作用明顯，保存4個(gè)月后蘋(píng)果試管苗節(jié)間極小、葉小色深呈蓮座狀，說(shuō)明B9的生長(zhǎng)延緩作用較為劇烈，所以不適宜蘋(píng)果試管苗的保存。

2.4 降低培養(yǎng)溫度

采用控制溫度來(lái)降低或完全抑制保存材料生長(zhǎng)是中期保存最常用的方法。不同植物種類(lèi)要求的最佳保存溫度不盡相同，甚至相差很大。一般耐寒物種在0～5℃下進(jìn)行保存，而一些亞熱帶物種一般要保存在10℃左右，一些熱帶物種則必須保存在15℃以上。Oka等在5℃下保存 “Senryo”梨（）和西洋梨品種“Winter Nelis”莖尖分生組織，64周后存活率及再生率幾乎為100%，而0℃下保存4周后即死亡。Reed在4℃下，用聚乙烯塑料袋保存96個(gè)較抗寒的草莓品種植株，12個(gè)月后，存活率達(dá)76%。蛇根木（）是一種瀕危的珍貴藥用植物，在25℃下離體保存節(jié)部組織，繼代周期為9個(gè)月，在15℃下為15個(gè)月，溫度如降為10℃和5℃，保存材料則壞死，2個(gè)月后都死亡。

2.5 提高培養(yǎng)基滲透壓

通常在培養(yǎng)基中加入甘露醇、蔗糖或者山梨醇等來(lái)提高培養(yǎng)基的滲透壓，從而抑制材料的生長(zhǎng)。這類(lèi)化合物是惰性物質(zhì)，不易被外植體吸收，而且抑制外植體生長(zhǎng)的作用持久。在MS培養(yǎng)基添加1%～3%甘露醇，淡黃花百合組培苗保存10個(gè)月后，存活率為92%左右，存活的組培苗接種于增殖培養(yǎng)基上，100%正常生長(zhǎng)和增殖。綠稈芋莖尖可在MS+ 0.2 mg/L NAA+4 mg/L BA+2 mg/L ABA+20 g/L甘露醇的培養(yǎng)基上，于15℃，100 lx光照的條件下保存350 d，單芽存活率達(dá)90%以上，且具良好的生長(zhǎng)與恢復(fù)分化的能力。以芽的葉柄為外植體，在MS+ 0.2 mg/L NAA+4 mg/L BA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一代繁殖系數(shù)可達(dá)5.5以上[4]。

除保存技術(shù)外，影響種質(zhì)資源中期保存效果的因素還有外植體類(lèi)型和生理狀態(tài)、保存容器的類(lèi)型、容積和封口方法等。如適于進(jìn)行中期保存的外植體類(lèi)型有愈傷組織、離體小苗、莖尖、莖段、叢芽等，同種植物的外植體類(lèi)型不同，保存效果也不同[5]，選擇合適的外植體類(lèi)型進(jìn)行保存是最重要的。

3 超低溫保存

超低溫保存是指在-80℃以下的超低溫中保存種質(zhì)資源的一整套生物學(xué)技術(shù)。超低溫常用的冷源有干冰（-79℃）、深冷冰箱、液氮（-196℃）及液氮蒸汽相（-140℃）。在超低溫條件下保存材料，可以大大減慢甚至終止代謝和衰老過(guò)程，保持生物材料的穩(wěn)定性，最大限度地抑制生理代謝強(qiáng)度，減少遺傳變異的發(fā)生。超低溫保存可以克服常溫及低溫保存過(guò)程中，由于繼代而產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性，并且還可以減少工作量，減少污染機(jī)會(huì)等。迄今，不同的植物材料如愈傷組織、胚軸、莖尖、花粉、根尖、休眠芽、原生質(zhì)體等的超低溫保存都有報(bào)道。愈傷組織的超低溫保存相對(duì)容易，方法簡(jiǎn)單，但由于其再生能力和遺傳的不穩(wěn)定性，不是理想的種質(zhì)保存材料。莖尖分生組織由于細(xì)胞分化程度小，在植物保存后的再生過(guò)程中，比其他細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳性穩(wěn)定，是超低溫保存的一種理想材料。植物細(xì)胞內(nèi)含有大量的水分，低溫冰凍過(guò)程會(huì)使水結(jié)冰，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)不可逆轉(zhuǎn)的破壞，導(dǎo)致死亡。因此，超低溫保存成功與否，關(guān)鍵是怎么避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，使細(xì)胞達(dá)到玻璃化?，F(xiàn)在常用的芽及莖尖分生組織超低溫保存的方法大致有5種。

3.1 慢凍法

通常是以0.5～1.0℃/min的降溫速度，從0℃降到-30～-40℃，隨后浸入液氮，或者以緩慢的速度連續(xù)降到-196℃。在有些情況下，在-30～-40℃預(yù)凍一段時(shí)間，然后才浸入液氮，此方法稱(chēng)之為兩步冰凍法或分步冰凍法。Brison等采用兩步冰凍方式，保存兩個(gè)桃砧木品種離體生長(zhǎng)的莖尖，再生率分別為69%和74%。這種方法需要程序降溫器，步驟較為繁雜。

3.2 快凍法

以超過(guò)40℃/min的速度降溫，或?qū)⒉牧现苯臃湃胍旱蚱湔羝嘀?。該方法較簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜昂貴的設(shè)備，可使細(xì)胞內(nèi)的水還未來(lái)得及形成冰晶，就降到-196℃的安全溫度。到20世紀(jì)90年代，傳統(tǒng)的快凍法已被玻璃化法取代。

3.3 玻璃化法

在冰凍前，使用高濃度的冰凍保護(hù)劑，即玻璃化液，在25℃或0℃處理一段時(shí)間，誘導(dǎo)脫水，然后直接浸入液氮中，此時(shí)，冰凍保護(hù)劑溶液和保存材料一同進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。此方法簡(jiǎn)單易行，省時(shí)省力，但對(duì)植物的毒害較大，較難在同一時(shí)間內(nèi)處理大量的材料。Kobayashi等將臍橙珠心細(xì)胞經(jīng)過(guò)一個(gè)玻璃化過(guò)程后，放入液氮中保存1 a，平均存活率超過(guò)90%，通過(guò)DNA及形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示遺傳物質(zhì)及再生的植株形態(tài)與保存前都沒(méi)有變化。Sakai等[6]將臍橙、葡萄柚等6種植物的珠心細(xì)胞通過(guò)玻璃化方式，在液氮中保存4個(gè)月，存活率也達(dá)90%。玻璃化保存的最大難題在于玻璃化冰凍保護(hù)劑的化合物組成及配制濃度。

3.4 包埋/脫水法

用藻酸鹽包埋莖尖，在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)后，在通風(fēng)櫥中處理2～6 h或用硅膠處理，通過(guò)空氣蒸發(fā)脫水，然后進(jìn)行超低溫保存。此方法一次能處理較多材料，避免了使用一些對(duì)細(xì)胞有毒性的冰凍保護(hù)劑，但在一些植物中，成苗率低，與玻璃化法相比，組織恢復(fù)生長(zhǎng)較慢，脫水所需時(shí)間長(zhǎng)。Niino等[7]利用包埋/脫水方式在液氮中保存蘋(píng)果、梨及桑樹(shù)離體生長(zhǎng)的莖尖5個(gè)月，存活率達(dá)80%以上；將這3種材料膠囊化，再經(jīng)過(guò)一個(gè)脫水過(guò)程（含水量在40%左右），放入-135℃下保存5個(gè)月，幾乎都能再生成芽。

3.5 包埋/玻璃化法

Phunchindawan等[8]將辣根芽原基膠囊化后，在0.5 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，再用高濃度的玻璃化溶液PVS2脫水4 h，直接放入液氮中保存3 d，69%存活。Matsumoto等將玻璃化與膠囊化方法結(jié)合起來(lái)，在液氮中保存山葵（莖尖分生組織，也取得了60%以上的存活率。

為了得到較高的超低溫保存成活率，現(xiàn)在的研究多重視對(duì)預(yù)培養(yǎng)條件的研究。其出發(fā)點(diǎn)是為了改變材料的生理狀態(tài)，增加細(xì)胞分裂與分化的同步化，減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，增加保護(hù)性物質(zhì)，使其能夠經(jīng)受起超低溫保存過(guò)程中的高度脫水和劇烈的溫度變化等逆境，從而獲得較高的保存成活率。常用的措施有①加入滲透保護(hù)物質(zhì)。在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入蔗糖[9]、聚乙二醇和二甲基亞砜可以提高成活率。②添加化學(xué)成分。預(yù)培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中添加ABA，水楊酸等化學(xué)成分來(lái)誘導(dǎo)材料對(duì)低溫的抗性，可以提高保存存活率。③低溫鍛煉。用低溫鍛煉的方法來(lái)提高材料的抗凍性，從而提高超低溫保存效率。

綜上所述，植物材料的超低溫保存，要根據(jù)材料本身的特性，對(duì)影響超低溫保存的因素進(jìn)行研究，尋找提高超低溫保存成活率和再生率的合理途徑，達(dá)到成功保存的目的。

4 展望

離體保存技術(shù)由于其具有省時(shí)、省地、省空間和無(wú)病蟲(chóng)害侵染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。我國(guó)水生蔬菜資源十分豐富，生態(tài)類(lèi)型也多種多樣，為保存這些特有的水生蔬菜資源，除了進(jìn)行田間保存，開(kāi)展離體保存顯得意義重大。目前，國(guó)家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃已對(duì)部分水生蔬菜資源如蓮藕、芋、慈姑、荸薺等的離體保存做了相關(guān)研究，雖已取得一定進(jìn)展，但許多問(wèn)題尚需進(jìn)一步探討，如存活率較低，在長(zhǎng)期（10 a，20 a，甚至更長(zhǎng)時(shí)間）保存后，材料的生活力和存活率如何？能否再生植株？另外，離體保存技術(shù)在植物育種和生物多樣性保護(hù)上的巨大潛力還有待于進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。離體保存技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)以及保存后植株遺傳穩(wěn)定性的研究都將是今后植物離體保存的研究重點(diǎn)。相信隨著研究工作的不斷拓展和深入以及技術(shù)設(shè)施的不斷改進(jìn)，離體保存技術(shù)將日臻成熟，有望在不久的將來(lái)得到更廣泛的利用。

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Progress in Techniques for in vitro Preservation of Plant Germplasm Resources

ZHONG Lan,LIU Yuping,PENG Jing

The conservation of plant germplasm resources has extremely vital significance for the biology biodiversity conservation and plant breeding of the new cultivar.The latest advances of techniques for in vitro preservation of plant germplasm resources were summarized.The problems and the perspective of this field were also discussed.

Plant germplasm resource;Preservation;Tissue culture;Cryopreservation

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.002

鐘蘭，女，博士，現(xiàn)從事水生蔬菜花卉研究與推廣，電話(huà)：027-88116313。E-mail：zhonglanlan_818@sina.com

2009-07-22