趙玉宏

摘 要：采用分光光度法測定波長410 nm處山藥多酚氧化酶（PPO）的活性，研究了pH、溫度、底物濃度、vmax和Km值以及抑制劑對山藥PPO活性的影響。結(jié)果表明,山藥PPO的最適pH=6.0,最適溫度為35℃，底物濃度低于0.06 moL?L-1時，山藥PPO活性與底物濃度呈線性關(guān)系，其Km=0.078moL?L-1,Vmax=0.259(△OD?min-1)，抑制劑檸檬酸、蘋果酸、L-抗壞血酸對山藥PPO活性均有抑制作用。

關(guān)鍵詞：山藥；多酚氧化酶；酶促褐變

中圖分類號：S632.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-569X(2009)01-0047-04

山藥(Rhizoma Dioscoreae)是一年生或多年生纏繞性藤本植物,在我國南方、西北、西南等地區(qū)種植普遍，資源豐富。山藥中含有大量的蛋白質(zhì)、各種維生素、有益的微量元素、粘質(zhì)多糖等營養(yǎng)成分，還含有尿囊素、山藥素、皂苷、膽堿、鹽酸多巴胺等藥用成分，是藥食同源食品[1]。多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO，氧化還原酶，EC．1.10.3.1)是廣泛存在于植物體、微生物（特別是霉菌）以及一些動物器官內(nèi)由核基因編碼、能催化多酚類氧化成醌類的含銅金屬質(zhì)體酶。PPO是引起山藥加工、貯藏過程中褐變主要酶類，影響產(chǎn)品的感官質(zhì)量[2-3]。本文對山藥PPO的部分特性進(jìn)行了研究，以對控制山藥褐變地發(fā)生，延長其儲藏期提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試山藥采自恩施土家族苗族自治州利川市團(tuán)堡鄉(xiāng)。

1.2 試劑和儀器

L—抗壞血酸、蘋果酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、甘氨酸、鹽酸、醋酸、醋酸鈉、丙酮，以上試劑均為分析純。

高速冷凍離心機(jī)(日本KUBOTA公司，KUBOTA6930)、可見分光光度系統(tǒng)(上海尤尼柯儀器有限公司，UNIC2100)、數(shù)顯水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司，HH-6）、電子分析天平（上海天平儀器廠，F(xiàn)A1004）。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥液的配制

各種緩沖液的配制參照王秀奇等[4]的方法。

鄰苯二酚需現(xiàn)配現(xiàn)用，用棕色試劑瓶保存。

1.3.2 山藥PPO的提取

取無損傷的新鮮山藥用預(yù)冷的蒸餾水沖洗干凈后，用不銹鋼刀迅速去皮，在流水條件下將去皮的山藥切成小塊，稱取10 g山藥，加入20 mL、濃度0.2 mol?L-1磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，在冰浴中搗碎研磨成勻漿，冷凍離心(7000 r/min,10min,4℃)后棄渣，上清液中加入適量冷丙酮，緩慢攪拌15 min，離心分離取沉淀物。沉淀物冷風(fēng)吹干后，加入25 mL，濃度為0.2 mol?L-1的磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，制成酶液，保存在—4℃條件下備用。

1.3.3 山藥PPO的活力測定

取磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)1.6 mL，加入1 mL濃度為0.04 mol?L-1的鄰苯二酚溶液，35℃恒溫5 min，加入0.1 mL山藥PPO粗酶液混和均勻，在410 nm波長下迅速測定吸光度A410。每30秒測一次，測5分鐘，每組重復(fù)三次。

一個酶活力單位定義為：吸光度值每分鐘改變0.001為一個酶活力單位(U)。

1.3.4 pH對山藥PPO活性的影響

用甘氨酸—鹽酸(0.05 mol?L-1)緩沖液、NaAc—HAc(0.05 mol?L-1)緩沖液、Na2HPO4—NaH2 PO4 (0.2 mol?L-1)緩沖液調(diào)配反應(yīng)體系的pH分別至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在35℃下水浴五分鐘后測定山藥PPO的活性。可以觀察pH=2.0時，吸光度測完后比色皿中溶液的顏色無變化而pH為3.0、4.0、5.0時顏色變?yōu)闇\褐色，pH至6.0、7.0、8.0時顏色更深，為褐色。

1.3.5 溫度對山藥PPO活性的影響

以0.04 mol?L-1的鄰苯二酚水溶液1.0mL為底物,加入pH=6.0的磷酸緩沖1.9mL，在不同溫度（20、25、30、35、40、50、60、70、80℃的溫度條件下保溫5分鐘，加入相同溫度下保溫5分鐘的PPO粗酶液0.1mL，混勻后迅速測定吸光度，轉(zhuǎn)換為PPO的活性。

1.3.6 底物濃度對山藥PPO活性的影響

分別以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol?L-1的鄰苯二酚水溶液為底物，在pH=6.0、35℃條件下,測定不同底物濃度下山藥PPO的活性。

1.3.7 山藥PPO的Km和Vmax的測定

參照Lineweaver—Burk雙倒數(shù)作圖法[5]估算酶動力參數(shù)Km和Vmax。

1.3.8 抑制劑對山藥PPO活性的影響

以0.04 mol?L-1鄰苯二酚水溶液為底物,在pH=6.0、35℃條件下測定濃度分別為0.01 mol?L-1、0.05 mol?L-1、0.1 mol?L-1、0.15 mol?L-1的L—抗壞血酸、檸檬酸和蘋果酸對山藥PPO活性的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對山藥PPO活性的影響

pH對山藥PPO活性的影響如圖1所示。

由圖1山藥PPO的活性與pH的關(guān)系曲線可以看出，pH值的變化對山藥PPO的活性影響較大，山藥PPO最適pH為6.0，這是因為其活性部位含有組氨酸基團(tuán)(pK=6.0)所致，在pH為2.0-3.0時酶活性較低。因此在山藥的加工處理中，可以調(diào)整pH至2.0以下，有利于減輕褐變。

2.2 溫度對山藥PPO活性的影響

酶活力隨溫度的變化曲線如圖2所示。

從圖2中可以看出，山藥PPO的最適溫度為35℃；溫度低于35℃時,隨著溫度增加，反應(yīng)速率加快；溫度高于35℃時，隨著溫度增加，蛋白質(zhì)分子的熱運動增大，促進(jìn)多重非共價鍵相互作用，導(dǎo)致蛋白分子破壞，使得山藥PPO變性，反應(yīng)速率逐漸降低；當(dāng)溫度超過45℃以上時鮮切山藥PPO的活力呈明顯下降趨勢；當(dāng)溫度達(dá)到80℃時，山藥PPO絕大部分失活；當(dāng)溫度接近90℃時PPO的活力已經(jīng)完全鈍化，此溫度可作為工業(yè)生產(chǎn)中山藥燙漂鈍酶的參數(shù)。這同許多果蔬的PPO的最適溫度在25-35℃之間的結(jié)果有所不同，如杏和香蕉中多酚氧化酶的活力分別在25℃和37℃時達(dá)到最高值[6-7]，馬鈴薯中多酚氧化酶以兒茶酚為底物時，它的活力在22℃時達(dá)到最高值[8]，這一差別的原因可能與山藥的粘液多糖有關(guān)，其在高溫下能形成膠狀物質(zhì)從而削弱熱的作用。

2.3 底物濃度對山藥PPO活性的影響

底物濃度與酶活力變化曲線如圖3所示。

根據(jù)圖3，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.06 mol?L-1，隨著底物濃度的增加導(dǎo)致反應(yīng)初速率有較大幅度的增加，多酚氧化酶活性與底物濃度呈線性關(guān)系；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.08 mol?L-1后，反應(yīng)初速率開始趨于平緩。

2.4 山藥PPO的Km和Vmax的測定

根據(jù)方程1/V=Km/Vmax{1/[S]}+1/Vmax，以1/V為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，以鄰笨二酚為底物時，山藥PPO的Km值為0.078mol?L-1，最大反應(yīng)速度Vmax為0.259 (△OD?min-1)。

2.5 抑制劑對山藥PPO活性的影響