李　偉　石崇榮　黃崇本　吳　一

[摘要]目的：探討青蒿琥酯鈉(Art)對兔耳增生性瘢痕中肥大細胞的影響。方法：用新西蘭大白兔制作增生性瘢痕動物模型，兔左耳為Art組，用60mg/ml Art 20μl/瘢痕作局部注射，每隔2天1次，共5次；右耳作為對照組，用5%NaHCO320μl/瘢痕作局部注射。HE、VG染色觀察成纖維細胞和膠原形態(tài)，甲苯胺藍染色作肥大細胞計數(shù)。結(jié)果：HE和VG染色顯示：Art組真皮層較薄，膠原纖維排列較整齊；對照組真皮層較厚，膠原排列紊亂，有漩渦狀結(jié)構(gòu)。肥大細胞計數(shù)Art組為（5.27±1.27）個/HP，對照組為（10.67±2.35）個/HP，兩組比較差異有顯著性意義。結(jié)論：青蒿琥酯鈉能減少瘢痕中肥大細胞數(shù)量，抑制成纖維細胞增殖，減少膠原合成。

[關(guān)鍵字]青蒿琥酯鈉；動物模型；增生性瘢痕；肥大細胞

[中圖分類號]Q 813.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）01-0066-03

Inhibiting effect of artesunate on mastocyte in rabbit ear hypertrophic scar

LI Wei1, SHI Chong-rong2, HUANG Chong-ben2, WU Yi1

(1.Department of Plastic Surgery,Chongqing Emergency Medical Center, Chongqing 400014; 2.Department of Burns and Plastic Surgery,the First Hospital Affiliated to Chongqing University of Medical Science,Chongqing 400016)

Abstract:ObjectiveTo probe into the inhibiting effect of Artesunate on Mastocyte in rabbit ear hypertrophic scar model.MethodsSix New Zealand rabbits were used to establish animal model for hypertrophic scar. The scars on the left ears were taken as Artesunate group receiving sodium Artesunate by local injection in a dose of 60mg/ml, 20μl pre scar every two days for 15 days. The scars on the right ears served as control group were treated with 5% sodium bicarbonate by local injection 20μl pre scar. After 15 days of treatment, the scars were harvested. HE and VG staining were used to observe the histomorphology of the fibroblasts and collagen fibers. Mastocyte were counted on Toluidine blue staining slide.ResultsOn gross examination,the hardness of the scars of the Artesunate group was lower than that of control group. The dermis of the Artesunate group was thinner than that of control group, the collagen was well-arranged in Artesunate group. HE and VG staining shown more fibroblasts and the collagen nodules could be found in control group. There was significant difference between the two groups in mastocyte counts(P<0.01).The mastocyte count of Artesunate group and control group were（5.27±1.27）/HP and（10.67±2.35）/HP respectively.ConclusionsIt shows Artesunate can inhibit fibroblast proliferation by reducing mastocyte and reduce collagen synthesis.

Key words: artesunate; animal model;hypertrophic scar;mastocyte

瘢痕的防治一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點，其手段主要有：手術(shù)切除、藥物注射、壓迫、硅膠貼膜、放射治療等方法，但這些方法都各有不足之處。1987年孫順仙發(fā)現(xiàn)青蒿素對實驗性矽肺有明顯的治療作用以來，文獻[1-3]對青蒿素及其衍生物抑制瘢痕形成的作用機理探討日趨深入。肥大細胞在瘢痕中扮演重要角色，本實驗旨在探討青蒿素對瘢痕中肥大細胞的影響，進一步揭示青蒿素防治瘢痕的機理。

1材料和方法

1.1 動物模型的制作：選用健康成年新西蘭大白兔6只（購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），兔耳健全，雌雄不拘，體重2～2.5kg，分籠飼養(yǎng)。

動物瘢痕模型的制作參照Morris氏[4]方法并加以改良：用3%戊巴比妥鈉1.5mg/kg作耳緣靜脈麻醉，嚴格無菌操作技術(shù)下，在兔耳腹側(cè)做1cm×1cm大小創(chuàng)面，去掉兔耳全層皮膚及軟骨膜，創(chuàng)緣用烙鐵燒灼，每只兔耳做6個相同創(chuàng)面。共72個創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露，待創(chuàng)面自行愈合，一般需16～19天。

1.2 實驗方法：待兔耳創(chuàng)面瘢痕形成后，取瘢痕標(biāo)本做切片，HE和VG染色證實為瘢痕組織。兔耳創(chuàng)面上皮化后（術(shù)后19天），選擇兔左耳瘢痕作為青蒿琥酯鈉（Art）組，兔右耳瘢痕作為對照組（5%NaHCO3組）。Art組用青蒿琥酯鈉（廣西桂林第二制藥廠惠贈）加5%NaHCO3配成60mg/ml，用微量注射器作局部瘢痕內(nèi)注射，注射時從瘢痕周圍的正常皮膚進針，注藥量20μl/瘢痕。對照組用5%NaHCO3作局部瘢痕內(nèi)注射，20μl/瘢痕。每隔2天1次，共5次。

1.3 觀察指標(biāo)：用藥后15天，3%戊巴比妥鈉1.5mg/kg作耳緣靜脈麻醉，切取瘢痕標(biāo)本。作HE、VG和甲苯胺藍染色的標(biāo)本用4%中性甲醛固定。

常規(guī)石蠟切片，厚約5μm，裱于經(jīng)多聚賴氨酸及APES雙重處理玻片上。脫蠟至水，HE染色，光鏡觀察并測量相對增高指數(shù)。VG染色觀察膠原情況。甲苯胺藍染色后光鏡下觀察并做肥大細胞計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計方法：數(shù)據(jù)用SAS軟件包作統(tǒng)計配對t檢驗。

2結(jié)果

2.1 大體觀察：Art組兔耳瘢痕質(zhì)地較柔軟平整。對照組瘢痕增生明顯，突起高于皮面。在×4低倍鏡下用測微尺測量相對增生厚度：增生厚度指數(shù)HI=(b+a)/a【a兔耳腹側(cè)皮膚厚度；b增生組織最大厚度】，見表1。

2.2HE和VG染色：對照組真皮層較厚，成纖維細胞數(shù)量多，膠原纖維致密粗大，排列紊亂，可見旋渦狀結(jié)構(gòu)和膠原結(jié)節(jié)（圖1、2）。Art組真皮層較對照組薄，成纖維細胞數(shù)量較少，膠原較疏松，排列較整齊，未見膠原結(jié)節(jié)和旋渦狀結(jié)構(gòu)（圖3、4）。

2.3肥大細胞染色：鏡下可見肥大細胞顆粒呈紅色，核呈藍色，在高倍（40）鏡下作肥大細胞計數(shù)（每張切片取上、下、中、左、右五個視野取平均數(shù)），對照組肥大細胞多見（圖5），Art組肥大細胞數(shù)量較少（圖6），結(jié)果見表2。

3討論

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是人類特有的一種病理現(xiàn)象，創(chuàng)傷后機體將啟動一系列修復(fù)程序，瘢痕形成是有多種細胞和細胞因子參與修復(fù)的過程。成纖維細胞合成多種細胞外基質(zhì)，膠原的過度沉積、排列紊亂及大量的粘多糖堆積導(dǎo)致瘢痕的形成，肥大細胞和成纖維細胞的相互作用對瘢痕的形成有重要影響。

在增生性瘢痕組織中肥大細胞數(shù)量是正常組織的4倍[5]，從瘢痕到其周圍正常皮膚可見肥大細胞逐漸由多到少[6]。Smith等[7]認為IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與了燒傷后瘢痕的形成，在IgE的啟動下，肥大細胞脫顆粒釋放組胺、肝素、嗜酸性粒細胞趨化因子、中性粒細胞趨化因子、慢反應(yīng)物質(zhì)、類胰蛋白酶等，肥大細胞數(shù)目及其顆粒同纖維化正相關(guān)[8-9]。

將肥大細胞和人肺成纖維細胞放在漂浮的I型膠原上共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)[10]：肥大細胞能增強成纖維細胞的收縮性，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，肥大細胞的活性能促使細胞外基質(zhì)重塑，從而導(dǎo)致纖維化和組織功能障礙。肥大細胞能增強FPCL（成纖維細胞-聚集的膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)）收縮，其增強方式不依賴于肥大細胞釋放的顆粒，而靠成纖維細胞和肥大細胞間的GJIC（縫隙連接介導(dǎo)的細胞間通訊）起作用[11]。

肥大細胞和3T3成纖維細胞共同培養(yǎng)時能顯著促進成纖維細胞的增殖和膠原的合成，并且這種作用能被抗過敏藥物奈多羅米鈉（nedocromil sodium）所抑制[12]。肥大細胞分泌的絲氨酸蛋白酶能使成纖維細胞失去接觸抑制，導(dǎo)致其增殖能力增強；NIH/3T3成纖維細胞能產(chǎn)生干細胞因子促進共同培養(yǎng)體系中肥大細胞增殖[13]。干細胞因子能上調(diào)肥大細胞對單核細胞趨化蛋白（MCP-1）的表達和合成，導(dǎo)致成纖維細胞對αⅠ型膠原mRNA的表達增強[14]。在低氧環(huán)境中，成纖維細胞和肥大細胞通過細胞接觸相互作用能增強瘢痕中HIF-ａ1和 VEGF的表達[15]，以上研究表明成纖維細胞和肥大細胞之間存在雙向調(diào)節(jié)作用。

肥大細胞同肌成纖維細胞有著密切的關(guān)系，常常聚集在一起，并且細胞之間直接接觸，肥大細胞的的絲狀偽足包繞于肌成纖維細胞質(zhì)周圍，肥大細胞釋放的顆粒常常聚集成團，靠近脫顆粒肥大細胞的細胞基質(zhì)中常含有大量的顆粒物質(zhì)，而且肌成纖維細胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張并有囊泡形成，肥大細胞和肌成纖維細胞之間的關(guān)系使肥大細胞及其釋放的介質(zhì)在病理性瘢痕的發(fā)病機制中起重要作用[16]。

肥大細胞脫顆粒釋放組織胺和肝素等產(chǎn)物調(diào)節(jié)成纖維細胞的活性，具有促成纖維細胞增殖和血管生成的作用[17]。體內(nèi)和體外實驗證明肝素及其衍生物影響 -平滑肌動蛋白（ -SMA）的表達，增強成纖維細胞表達 -SMA，在瘢痕的演變中扮演重要角色。表達 -平滑肌動蛋白的成纖維細胞是肌成纖維細胞（MFB）的典型標(biāo)志，MFB是一種非典型的成纖維細胞，在超微結(jié)構(gòu)上具有成纖維細胞和平滑肌細胞的特性，具有合成細胞基質(zhì)和收縮的功能。研究發(fā)現(xiàn)：組織胺和類胰蛋白酶能促進成纖維細胞增殖和膠原合成[18]，類胰蛋白酶是成纖維細胞的有絲分裂劑，具有促進成纖維細胞分裂增殖作用[9]。

本實驗利用甲苯胺藍對兔耳增生性瘢痕塊染色，觀察到肥大細胞位于真皮層，Art組肥大細胞數(shù)目為（5.27±1.27）個/高倍視野，對照組為（10.67±2.35）個/高倍視野，經(jīng)統(tǒng)計差異有顯著性意義（P<0.01）。Art組增生性瘢痕較對照組薄，成纖維細胞數(shù)量較少，膠原纖維排列較對照組整齊。結(jié)果表明青蒿琥酯鈉能抑制肥大細胞增殖，減少肥大細胞產(chǎn)物，從而抑制成纖維細胞增殖和膠原的合成。

[參考文獻]

[1]李偉,石崇榮,曹治東,等.青蒿琥酯鈉對兔耳增生性瘢痕膠原的影響[J].中華整形外科雜志,2005,21(2):158-159.

[2]馮登超,賀光照,江川,等.二氫青蒿素抑制兔耳瘢痕增生的實驗研究[J]. 中國美容醫(yī)學(xué),2008,17(3):380-382.

[3]孔恒,余清聲,朱柳,等. 青蒿琥酯誘導(dǎo)瘢痕成纖維細胞凋亡的實驗研究[J]. 中國修復(fù)重建外科雜志,2007,21(9):970-974.

[4]Morris DE, Wu L,Zhao LL,et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring:quantitative[J]. Plast Reconstr Surg,1997,100(3):674-681.

[5]鮑衛(wèi)漢,陳東明.瘢痕熱點問題研究[J].引進國外醫(yī)藥技術(shù)與設(shè)備,1999,5(11):6-10.

[6]王少華,呂世軍,王燕華,等.瘢痕疙瘩中肥大細胞的形態(tài)特征及臨床意義[J].現(xiàn)代康復(fù),2000,4(5):712-712.

[7]Smith CJ, Payne VM, Scott SM, et al. Immunoglobulin E levels and anticollagen antibodies in patients with postburn hypertrophic scars[J]. J Burn Care Rehabil, 1997,18(5): 411-416.

[8]Li QY, Raza-Ahmad A, MacAulay MA, et al. The relationship of mass cells and their secreted products to the volume of fibrosis in posttransplant hearts[J]. Transplantation, 1992, 53(5):1047-1051.

[9]Ruoss SJ, Hartmann T, Caughey GH. Mast cell tryptase is a mitogen for cultured fibroblasts[J]. J Clin Invest, 1991,88(2):493-499.

[10]Skold CM, Ohkuni Y, Liu XD, et al.Co-cultured human mast cells stimulate fibroblast-mediated contraction of collagen gels[J]. Inflammation,2001,25(1):47-51.

[11] Moyer KE, Saggers GC, Ehrlich HP. Mast cells promote fibroblast populated collagen lattice contraction through gap junction intercellular communication[J].Wound Repair Regen,2004,12(3):269-275.

[12] Levi-Schaffer F, Rubinchik E. Activated mast cells are fibrogenic for 3T3 fibroblasts[J]. J Invest Dermatol,1995,104(6):999-1003.

[13] Gyotoku E, Morita E, Kameyoshi Y, et al. The IL-6 family cytokines, interleukin-6, interleukin-11, oncostatin M, and leukemia inhibitory factor, enhance mast cell growth through fibroblast-dependent pathway in mice[J]. Arch Dermatol Res, 2001, 93(10):508-514.

[14] Yamamoto T, Hartmann K, Eckes B, et al. Role of stem cell factor and monocyte chemoattractant protein-1 in the interaction between fibroblasts and mast cells in fibrosis[J]. J Dermatol Sci,2001,26(2):106-111.

[15] Zhang Q, Oh CK, Messadi DV,et al. Hypoxia-induced HIF-1 alpha accumulation is augmented in a co-culture of keloid fibroblasts and human mast cells: involvement of ERK1/2 and PI-3K/Akt[J]. Exp Cell Res,2006 ,312(2):145-155.

[16] Lee YS, Vijayasingam S.Mast cells and myofibroblasts in keloid: a light microscopic, immunohistochemical and ultrastructural study[J].Ann Acad Med,1995,24(6):902-905.

［17］程 飚，付小兵，盛志勇.免疫因素在瘢痕形成和發(fā)展中的作用[J].中國臨床康復(fù),2002,6（4）：472-473.

[18] Garbuzenko E, Nagler A, Pickholtz D, et al. Human mast cells stimulate fibroblast proliferation, collagen synthesis and lattice contraction: a direct role for mast cells in skin fibrosis[J]. Clin Exp Allergy,2002,32(2):237-246.

[收稿日期]2008-08-26[修回日期]2008-12-03

編輯/張惠娟