孫　靜　巫志峰　韓　凌

【摘要】 應用微量序列特異性引物聚合酶鏈反應技術（Micro-PCR-SSP），探討我國廣東籍漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）與HLA-DQB1基因的相關性。對38例SLE患者和110例正常對照者的血樣進行分析，實驗表明，SLE患者DQB1*0601等位基因頻率顯著升高（RR＝2．19，P=0．0055），可能是易感基因，而DQB1*0301與DQB1*0401基因頻率則顯著降低（ DQB1*0301，RR＝0．1253，P=0．0001; DQB1*0401，RR＝0，P＝0．0409），可能為保護基因。

【關鍵詞】HLA-DQB1等位基因；系統(tǒng)性紅班狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病機制極為復雜，常累及多個臟器，發(fā)病有一定的遺傳傾向。人類白細胞抗原系統(tǒng)（human leukocyte antigens，HLA）是一組組成和結構都有非常復雜的基因復合體，HLA最主要的特點是具有高度多態(tài)性，特別是在HLA-Ⅱ類基因的第二外顯子區(qū)，這種多態(tài)性更為明顯。與SLE有關的主要是HLA-Ⅱ類基因^[1]，HLA-Ⅱ類基因座在HLA-D區(qū)，包括HLA-DQ、DR、DP三個亞區(qū)，已知HLA-DQ的多態(tài)性與SLE自身抗體的產(chǎn)生關系最密切^[2]。本中心實驗室應用微量序列特異性引物聚合酶鏈反應技術（Micro-PCR-SSP）從分子遺傳學角度，探討HLA-DQB1與廣東漢族人SLE患者的遺傳易感性關系。

1 材料和方法

1．1 研究對象 擬選廣東籍漢族SLE患者38例，SLE患者均符合1992年美國風濕病協(xié)會修訂的診斷標準。選取連續(xù)三代均為廣東籍無親緣關系的健康者100例作為對照組，與患者無血緣關系。

1．2 標本采集 抽取SLE患者與正常人靜脈血各2 ml，ACD-B抗凝。

1．3 試劑

1．3．1 引物設計 按文獻^[3]合成28條核苷酸鏈，組成20對引物。

1．3．2 Taq酶購自上海生工生物工程技術有限公司。

1．3．3 DNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1．4 基因組DNA的制備 取2 ml ACD-B抗凝全血3000轉/min，離心10 min，吸取200 μl白膜層加入1．5 ml離心管中，加入25 μl QIAGEN蛋白酶K和200 μl AL緩沖液，混勻15 s，70℃孵育10 min，然后加入200 μl無水乙醇混勻，將上述混合液轉至DNA親和柱上，離心10 000轉/min 1 min，去除濾過液，在柱上加入500 μl AW1緩沖液，離心1 min，再加入AW2緩沖液，重復洗滌一次，然后加入200 μl的AE緩沖液，室溫孵育5 min，最后離心1 min洗脫DNA，并測定DNA的濃度和純度。

1．5 DNA擴增在SSP-PCR反應體系中，每一DNA均作20支反應管，每管反應液50 μl，含25 μmol/L dNTP,10×PCR緩沖液1．5 μl，MgCL 21．5 mmol/L，Taq酶1 U，模板DNA 50~100 ng，等位基因專一性引物各0．25 μmol/L。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃1 min預變性，然后94℃ 30 s、60℃30 s、72℃ 60 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴增結束后，將擴增產(chǎn)物轉至2%瓊脂糖凝膠微量膠內(nèi)，125伏電壓電泳15 min，然后在凝膠一次性成像儀上觀察并拍照。

1．6 統(tǒng)計學分析 用直接計數(shù)法計算基因頻率。用Fisher精確法統(tǒng)計P值和相對危險度（RR）。顯著檢驗水平為0．05。

2 結果

從表中可以看出，與正常對照組相比，SLE患者組中DQB1*0601等位基因頻率顯著升高（RR＝2．19，P=0．005 5），而DQB1*0301與DQB1*0401基因頻率則顯著降低（ DQB1*0301，RR＝0．1253，P=0．000 1; DQB1*0401，RR＝0，P＝0．040 9）。

3 討論

人類主要組織相容性復合體(MHC)含128個功能基因，其中39．8%的基因和免疫系統(tǒng)有關，因此39．8%基因可能與許多免疫疾病的發(fā)生直接或者間接相關^[4]。近年來國外的許多研究資料表明，在遺傳因素方面，SLE與HLA基因的遺傳易感性關系存在著種族和人群差異的影響，尤其DQ位點的作用引人注目。筆者通過應用PCR-SSP技術獲得了廣東正常人群和SLE患者基因頻率，結果發(fā)現(xiàn)SLE患者DQB1*0601等位基因頻率較正常人顯著升高，提示DQB1*0601可能是SLE的易感基因，而正常人DQB1*0301與DQB1*0401的等位基因頻率顯著升高。在高加索人種的SLE患者中，HLA-DQB1易感基因可能是DQB1*0602，*0602和*0301；保護基因可能是DQB1*0501；在日本SLE患者中，易感基因可能是DQB1*0602。這些研究結果與筆者對廣東SLE患者的研究結果存在明顯差異。而國內(nèi)陳躍華^[5]等分析中國漢族人群HLA-DQ基因多態(tài)性與SLE的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)等位基因DQA1*0102、DQB1*0601是中國漢族人群SLE患者的危險基因（P<0．05）,而等位基因DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401與DQB1*0503是中華漢族人群SLE患者的保護基因，這與筆者的研究結果較為一致，本研究結果進一步證實了HLA-DQB1基因在SLE患者中的分布存在著地區(qū)和種族的差異。

參 考 文 獻

［1］ 楊穎，熊平，魏承洪，等．HLA-DRB1等位基因與中國湖北漢族人SLE關聯(lián)的研究．中華微生物學和免疫學雜志，1996，16(5)：340-342.

［2］ 彭學標，費虹明，岳曉玉，等．HLA-DR、DQ基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關性的研究．中華微生物學和免疫學雜志，1997，17(6)：438-441.

［3］ O Olrup，A Aldener，A.fogdell.HLA-DQB1 and-DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PSR-SSP) in 2 hours.Tissue Antigens，1993,41:119-134.

［4］ 謝尚葵，馮樹芳，沈福民，等．系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床表現(xiàn)與HLA-Ⅱ類單倍型關聯(lián)的研究．中華微生物學和免疫學雜志，2000，20(1)：66-69.

［5］ 陳躍華，陳明，范昌斌,等.中國漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡與HLA-DQ基因多態(tài)性的Meta分析.安徽醫(yī)學，2006,（3）:175-177.