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摘 要:經(jīng)過近20年的不斷開發(fā)和完善,巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)已經(jīng)成為目前最成功的真核表達系統(tǒng)之一,被廣泛用于醫(yī)藥生產(chǎn)、飼料添加劑開發(fā)和科學(xué)研究。介紹了畢赤酵母的生物學(xué)特性、常用菌株和表達載體的特點及其研究進展,并闡述了其在外源蛋白的表達方面具有的獨特優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞:畢赤酵母;表達載體;外源蛋白

中圖分類號:Q78

文獻標識碼:A

文章編號:1005-569X(2009)12-0037-03

1 引 言

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)是一類在缺乏葡萄糖或甘油時,能利用甲醇做為唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉價的非選擇性培養(yǎng)基中生長,有較寬的生長pH適應(yīng)范圍(3.0～8.0),有較好的發(fā)酵基礎(chǔ),非常有利于實現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng),菌體密度可高達100g干細胞/L,它們生長的適宜溫度一般為28～30℃,是常用的外源蛋白表達系統(tǒng)。

2 巴斯德畢赤酵母宿主菌株

根據(jù)對甲醇利用的情況,P.pastoris可劃分為三種表型:第一型,即Mut+型,此型畢赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似,稱為甲醇利用正表型。絕大多數(shù)畢赤酵母為Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型畢赤酵母的AOX1基因部分敲除,被釀酒酵母ARG4基因所取代,AOX2雖然與AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培養(yǎng)基內(nèi)該型畢赤酵母生長緩慢,稱為甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型畢赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,細胞不能進行甲醇代謝,無法在甲醇中生長,為甲醇利用負表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。后兩者表達外源蛋白有時優(yōu)于野生株,且需甲醇較少,有時其表達量甚至高于Mut+型。三型菌株在AOX1啟動子調(diào)控下均可誘導(dǎo)異源蛋白的表達。對這三種菌株的進一步改造,還可得到其它衍生宿主菌,現(xiàn)已獲得十幾種不同基因型的衍生宿主菌。目前,使用最廣泛的巴斯德畢赤酵母宿主菌是Cregg在1985年建立的GS115,它具有組氨酸脫氫酶缺陷型基因His4,可接受His4的載體而具有His+表型。

3 畢赤酵母表達載體

畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒,所以表達載體需與宿主菌染色體發(fā)生同源重組,將外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達[1]。表達載體主要元件包括:啟動子、多克隆位點、終止序列、選擇標志以及可以誘導(dǎo)基因發(fā)生重組的同源序列。

表達載體都是穿梭質(zhì)粒,先在大腸桿菌中復(fù)制擴增,然后被導(dǎo)入宿主酵母細胞。因此,表達載體還含有大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制單元(ColE1)以及篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的標記(如Ampr,Kanar)。若要表達產(chǎn)物分泌到細胞外,表達載體還需攜帶信號肽序列。

3.1 啟動子

目前最常用的啟動子是來源于巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因的啟動子PAOX1。它是一個很強的啟動子,能非常有效地控制外源基因的表達。雖然利用PAOX1已成功表達了多種外源蛋白,但以PAOX1為啟動子的表達系統(tǒng)還有一定缺陷,例如不適用于食品生產(chǎn),添加甲醇誘導(dǎo)時存在火災(zāi)隱患。3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子PGAP是Waterham等近年來克隆成功的一個構(gòu)成性表達的啟動子,它突出的特點是發(fā)酵過程操作簡便,可以連續(xù)表達,無需誘導(dǎo)。利用PGAP表達外源基因主要的限制是目的蛋白不能對宿主菌有毒性,否則在長期的發(fā)酵過程中將限制其生長。

Shen等又克隆出FLD1(谷胱甘肽依賴性甲醛脫氫酶基因)啟動子,它具有與AOX1啟動子相同或更高的強度,能在甲胺(葡萄糖、甘油等)或甲醇為唯一碳源的情況下表達,甲胺不易揮發(fā),更適于搖瓶研究。這三種啟動子都是導(dǎo)致外源基因過高表達的啟動子,但有研究發(fā)現(xiàn),某些外源基因可因被啟動的表達水平過高,而導(dǎo)致目的蛋白折疊失準,加工無能或定位錯誤。因此,近年來人們又研制了啟動基因柔和表達的啟動子如PEX8和YPT1啟動子,但它們的表達水平要低于上述三種強啟動子。這些啟動子各有優(yōu)缺點,在實驗設(shè)計中應(yīng)根據(jù)自己的需要選擇合適的啟動子。

3.2 選擇標志

常用的選擇標記可以分為兩種:①營養(yǎng)缺陷型選擇標記,如來源于巴斯德畢赤酵母的HIS4基因和來源于釀酒酵母的ARG4基因和SUC2基因;②抗性選擇標記,如來源于大腸桿菌Tn903能夠使真核細胞對卡那霉素家族成員G418產(chǎn)生抗性的kanr基因,又如來源于印度斯坦鏈異壁菌(streptoalloteichus hindustanus)能夠使細菌和真核細胞對博萊霉素家族成員Zeocin產(chǎn)生抗性的Shbler基因,但Zeocin是一種強誘變劑,可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生不可預(yù)料的突變。近來,還成功獲得一系列新的營養(yǎng)篩選標記,如巴斯德畢赤酵母氨基咪唑琥珀酸草酰二胺合成酶基因(ADE1)和乳清酸核苷-5&-磷酸脫羧酶基因(URA3)。

3.3 信號肽

分泌性的外源蛋白可以采用自身的信號肽來實現(xiàn)分泌,但是大多數(shù)外源信號肽不能在畢赤酵母中有效表達,可以考慮采用酵母自身的信號肽。由于畢赤酵母表達的分泌性蛋白很少,不易找到合適的信號肽,從釀酒酵母分離到的α-交配因子前導(dǎo)肽,它不僅可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)沿分泌通路分泌到細胞外,而且在分泌過程中可以被自身的膜蛋白酶Kex2自動切割去除。

如果表達胞內(nèi)蛋白的話就不需要信號肽了,可以在目的蛋白前加一個定向肽(peroxisome targetingsignal,PTS),可以把目的蛋白聚集到微體中,既避免了胞內(nèi)過量積累外源蛋白對細胞正常生理功能的影響,又可以保護外源蛋白免受胞內(nèi)蛋白酶的降解。

4 利用畢赤酵母表達外源蛋白的優(yōu)缺點

畢赤酵母作為一個真核表達系統(tǒng)既具有原核表達系統(tǒng)生長力旺盛、對營養(yǎng)物質(zhì)的要求低、生活周期短、易培養(yǎng)的優(yōu)點,也具備其作為近幾年來廣泛應(yīng)用的表達系統(tǒng)的獨特優(yōu)勢,可以對表達的外源蛋白進行加工修飾使蛋白更接近天然的狀態(tài),形成有活性的蛋白。與第一代真核表達系統(tǒng)釀酒酵母相比,畢赤酵母表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢:

(1)穩(wěn)定性高。由于畢赤酵母沒有游離的質(zhì)粒,外源基因進入細胞后通過交換整合進入酵母的基因組中成為畢赤酵母基因組的一部分,外源基因不會丟失,遺傳穩(wěn)定性好。

(2)表達量高。在畢赤酵母中采用了AOX1啟動子作為外源基因的啟動子,AOX1啟動子是一個強啟動子,在甲醇誘導(dǎo)下可以實現(xiàn)外源基因的高效表達,比以往的表達系統(tǒng)提高了10～100倍[2]。而且由于AOX1是甲醇誘導(dǎo)型的可以通過控制甘油和甲醇的比例來控制外源蛋白的表達。

(3)分泌效率高。采用釀酒酵母α成熟因子(α-MF)信號序列可以實現(xiàn)大多數(shù)蛋白的分泌表達,也有采用外源蛋白自身信號肽來分泌并獲得成功的例子,如HAS[3]、轉(zhuǎn)化酶[4,5]、牛的溶菌酶[6]。

(4)自身分泌的蛋白較少。細胞外大部分是目的蛋白,而且營養(yǎng)要求簡單,培養(yǎng)基中其他的蛋白成分少,背景比較干凈清楚,這就為下游分離純化蛋白提供了便利。

(5)糖基化更接近蛋白的天然狀態(tài)[7],糖基側(cè)鏈較釀酒酵母短約為它的20%[8],作為藥物治療時不會引發(fā)免疫反應(yīng)。

此外,畢赤酵母偏好有氧的生長環(huán)境,菌體可以達到很高的密度(細胞干重可達100g/L以上),適應(yīng)較寬的pH(3.0～8.0),這些特點使得畢赤酵母適于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵來產(chǎn)生大量的外源蛋白。

但是畢赤酵母表達系統(tǒng)也有一些不盡如人意的地方需要改進:

(1)甲醇做誘導(dǎo)物存在安全隱患。甲醇有毒過量能夠?qū)е率?表達一些口服藥物以及食品蛋白時往往不能被人們接受,而且甲醇易揮發(fā),為大規(guī)模的工業(yè)化生長帶來了火災(zāi)的遺患。

(2)畢赤酵母的遺傳背景還沒有釀酒酵母那么清楚,為開展實驗帶來了諸多不便。

(3)目前有越來越多的低表達或不表達的報導(dǎo)出現(xiàn),比如多瘤病毒大T抗原,還有的甚至不能表達(如HIV表面糖蛋白)[9]。影響蛋白表達量的因素很多,需要不斷摸索尋找最佳表達條件,實際操作很繁瑣。

5 結(jié) 語

巴斯德畢赤酵母是一種嗜畢赤酵母,起初是菲利普石油公司為了生產(chǎn)家畜飼料單細胞蛋白而開發(fā)的,它可以在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。自l987 年Gregg等首次在畢赤酵母中表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)以來,國內(nèi)外已有數(shù)百種外源蛋白獲得表達。

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的諸多優(yōu)勢使之越來越受到關(guān)注,其研究和商業(yè)價值亦不斷體現(xiàn)。近年來,隨著對該甲醇營養(yǎng)酵母分子遺傳學(xué)研究和認識的進一步深入和實踐經(jīng)驗的不斷積累,巴斯德畢赤酵母基因表達系統(tǒng)的應(yīng)用范圍大大加寬,表達產(chǎn)物除了人畜藥用制品外,還包括來自植物、動物和細菌的各種酶、膜受體蛋白、含輔基的蛋白質(zhì)以及可用于研究晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)等,它還可以同時表達酶組分比例適當?shù)囊粋€酶系而以全細胞作為生物催化劑,對整個生命科學(xué)和人類健康產(chǎn)生重要影響。同時我們也相信,該表達系統(tǒng)必將在我國21世紀基因工程真核表達產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化、商品化進程中,發(fā)揮越來越大的作用。

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