樊娜娜 郭 曉 劉生祥 楊 煜 張柏順 范仲學 李廣存

摘 要:馬鈴薯是重要的糧菜兼用作物,但其受青枯病的影響嚴重,一直以來沒有根本的防治措施。隨著分子生物學的發(fā)展,利用基因工程技術研究抗青枯病相關基因的功能,進而進行遺傳轉化,培育抗病品種(系)將成為一條經濟有效的途徑。本文在前期研究的基礎上對幾種抗青枯病相關基因的研究進展、RNAi技術在研究基因功能中的作用以及農桿菌介導的遺傳轉化技術的應用等進行了綜述。

關鍵詞:馬鈴薯;青枯病;基因;RNAi

中圖分類號:Q789 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2009)12-0012-05

馬鈴薯原產于南美洲的秘魯和玻利維亞等地,后在世界各地廣泛種植,是重要的糧菜兼用作物,單位面積產量高,營養(yǎng)豐富,用途廣泛,經濟價值高,抗旱性好,耐貯藏。目前馬鈴薯在我國的種植面積和產量均居世界首位。近幾年,隨著種植業(yè)結構的調整及西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實施,馬鈴薯正成為我國許多省及自治區(qū)的經濟作物和優(yōu)勢產業(yè),種植面積也逐漸擴大。馬鈴薯青枯病是由青枯病菌(也叫茄科雷爾氏菌,即Ralstonia solanacearum)引起的一種細菌性土傳病害,寄主范圍廣,涉及50多個科的數(shù)百種植物[1]。該病目前還沒有有效的防治措施,化學藥劑防治易造成環(huán)境污染和病原菌抗性小種突變,農業(yè)綜合防治效果有限。選育抗青枯病品種是最為經濟有效的途徑之一,然而,迄今為止,尚未在馬鈴薯栽培種中發(fā)現(xiàn)有效的青枯病抗源。研究發(fā)現(xiàn),二倍體馬鈴薯野生種中存在青枯病抗源,但由于青枯病抗性機制復雜,存在寄主、環(huán)境、病原小種的互作效應等,人們對青枯病的抗性機制仍然知之甚少。隨著分子生物學的發(fā)展,克隆抗病基因并進行同源基因轉化,培育抗病品種已成為一條重要而有效的途徑,例如抗蟲棉的獲得等。因此本文對獲得的幾個抗青枯病相關基因的研究進展及基因功能驗證方法進行了綜述。

1 馬鈴薯抗病相關基因的研究進展

1.1 編碼蛋白激酶的基因

蛋白激酶是通過催化蛋白質磷酸化進而改變其活性的一類酶,這類酶以ATP 或GTP 作為磷酸基團的供體,并將磷酸基轉移到底物中特定的氨基酸殘基上。根據(jù)蛋白激酶磷酸化底物中氨基酸殘基的不同,可將真核生物中的蛋白激酶分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶( STK) 和酪氨酸蛋白激酶( PTK)兩大類,這兩類蛋白激酶功能域相似,但卻具有各自特征性的氨基酸序列區(qū)段,從而決定它們催化底物的特異性[2]。

1.1.1 植物蛋白激酶的功能

植物中的蛋白激酶幾乎與所有的發(fā)育過程有關,在發(fā)育、自交不親和、雄性不育、抗逆和抗病等生命活動過程中均起著重要的調控作用[3]。蛋白質磷酸化與去磷酸化過程在細胞的信號轉導中起重要作用,是生物體中普遍存在的一種調節(jié)機制。許多比較復雜的信號轉導系統(tǒng)都牽涉到瀑布式的由多個蛋白激酶所催化的磷酸化反應,從而使最初感受到的信號得到放大[4]。以往人們對蛋白激酶的了解絕大部分來自動物和酵母,植物蛋白激酶的研究起步較晚,但進展很快。動物蛋白激酶的絕大多數(shù)種類已在植物中發(fā)現(xiàn)。研究表明,植物中的蛋白激酶大都屬于絲/蘇氨酸類蛋白激酶。如水稻抗白葉枯病基因Xa21[5] 和Xa26[6都編碼具有LRR 區(qū)的絲/蘇氨酸激酶。水稻抗稻瘟病基因Pi2d2[7]編碼的蛋白質胞外是B凝集素(B-lectin) 結構,胞內是絲/蘇氨酸激酶區(qū)。Sasabe等[8]從煙草中分離的3個NtlecRK能被激發(fā)子(elicitor) 誘導,N端是豆凝集素結構域,有跨膜區(qū),C端是絲/蘇氨酸類型的激酶結構域。擬南芥的FLS2基因編碼含LRR 結構域的類受體激酶,在植物抗病和病原菌識別中起重要作用[9]。大麥的Rpg1基因編碼的蛋白激酶具有抗銹病的功能[10]。不僅如此,某些植物特有的蛋白激酶研究也取得了進展。如TDY類絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 有60～80個氨基酸的N端KD區(qū),有些具有C端CD區(qū)作為MAPKK、磷酸酶和底物蛋白的停泊位點[11]。TDY類MAPK的功能主要與機械性傷害、紫外線脅迫、H2O2 脅迫及重金屬脅迫等各種環(huán)境脅迫相關。TDY類MAPK相對于其它類的MAPK在進化上是相對獨立的,具有多個起源。

1.1.2 植物蛋白激酶中的類受體激酶

與動物中的受體激酶類似,植物中的蛋白激酶是一類定位在質膜上,包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內激酶域的膜蛋白[12]。這類蛋白激酶的分子結構和功能類似動物細胞中的受體蛋白激酶(receptor protein kinase, RPK),且絕大多數(shù)尚未鑒定出其配基,故稱之為類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinases, RLKs)[13]。不同類受體激酶胞外受體結構的差異較大,據(jù)此,可將植物類受體激酶細分為6個亞家族[14]:(1) 具S結構域( S-domain) 的RLK (S-RLK) :其胞外受體部分具有同油菜自交不親和糖蛋白相似的S結構域; (2) 富含亮氨酸(leucine-rich repeat) 的RLK(LRR- RLK) :具有重復出現(xiàn)的富含亮氨酸的胞外結構域,在分子識別中起重要作用,目前發(fā)現(xiàn)的類受體激酶大多屬于這一類;(3) 類腫瘤壞死因子受體( tumor-necrosis factor receptor, TNFR) RLK:其胞外受體部分具有特定排列的6個半胱氨酸;(4) 類表皮生長因子( epidermal growth factor, EGF) RLK:這個亞家族的成員具有類似EGF的結構域;(5) PRLK (pathogenesis related protein):該類成員具有PR5相似的結構;(6) 類凝集素(lectin) RLK:其受體部分具有與胞外凝集素相似的結構域。

隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn):植物類受體激酶能夠在質膜感知外界信號刺激,并傳導至胞內,從而引發(fā)一系列的生理生化反應,成為植物正常生長發(fā)育和抵抗病原菌侵擾不可缺少的參與成員[15],如LRR-RLK參與蛋白-蛋白互作,在分子識別過程中發(fā)揮重要的作用[16]; S-RLK與植物的自交不親和有關,是自交不親和反應中雌蕊一方的重要因子, S-RLK基因發(fā)生突變可導致自交不親和性喪失[17];擬南芥的RPK1是位于質膜上的一種LRR 受體激酶,在ABA 的信號轉導途徑中起主要作用[18]。本實驗室所研究的RHG1類受體激酶屬于富含亮氨酸的RLK,該受體激酶基因受青枯病菌的誘導,但不受茉莉酸(JA)的調節(jié),推測該受體激酶可能作為受體參與了信號識別和抗青枯病反應。

1.2 編碼果膠甲酯酶抑制子的基因

果膠是植物細胞壁的主要成分,最初是以高度甲酯化的形式被分泌出來,被果膠甲酯酶去甲酯化后進入細胞壁。果膠甲酯酶對植物發(fā)育具有重要的作用[19]。果膠甲酯酶活性的調控受多種因素的影響,果膠甲酯酶抑制子是其中重要的影響因素。自Balestrieri等[20]在研究獼猴桃果膠甲酯酶的特性時發(fā)現(xiàn)一種對果膠甲酯酶有抑制作用的蛋白后,在土豆汁液、香蕉果實和無花果中均發(fā)現(xiàn)對果膠甲酯酶有抑制作用的物質,這些物質統(tǒng)稱為果膠甲酯酶抑制劑[21]。果膠甲酯酶抑制子(Pectin methylesterase inhibitors, PMEIs)通過作用于果膠甲酯酶(PME)形成1∶1的非共價可逆復合體而起作用,這種復合體的穩(wěn)定性受pH值的強烈影響,二者的親和力隨pH值的降低而升高,致使PME的活性受到抑制。同時pH值的降低也使得細胞中的糖苷酶和糖基轉移酶被激活,而糖苷酶和糖基轉移酶對于細胞壁的擴展和建立具有重要作用[22],這預示著PME的活性可以通過直接調節(jié)pH值及PME與PMEI的親和力來實現(xiàn)[23]。An等[24]從辣椒中分離和鑒定了CaPMEI1基因,該基因在發(fā)生葉枯病的辣椒葉片中編碼一種果膠甲酯酶抑制子。重組基因CaPMEI1編碼的蛋白不僅抑制PME,而且可作為某些植物病原菌的抗體。在辣椒中,病毒誘導該基因沉默使得辣椒對Xcv(辣椒斑點病細菌)的敏感性增加,并且一些防御相關基因的表達量也減少。這些結果表明,該基因除了參與抗旱和抗氧化脅迫之外,還參與基本的抗病防御。本實驗室自馬鈴薯中獲得的StPMEI基因的表達受青枯病菌侵染的抑制,這可能會導致因PMEI的量不足而無法形成足夠的非活性狀態(tài)的PME∶PMEI復合物,從而使PME表現(xiàn)出活性,通過催化產生的具有非酯化的羧基基團與細胞中Ca2+作用形成不溶性的果膠酸鹽,加固細胞壁達到早期防御病原侵染的目的。同時該基因又受JA的誘導而上調表達,推測這可能會使得PME以非活性PME∶PMEI復合物的形式存在,引起細胞內pH值的降低,最終使得細胞中的糖苷酶和糖基轉移酶被激活,這對于細胞壁的擴展和建立具有重要的作用。影響PME活性的因素較為復雜,PMEI究竟如何通過抑制PME而起作用尚不十分清楚,有關該研究所獲得的StPMEI基因在馬鈴薯中所扮演的角色正在進一步研究中。

1.3 編碼蛋白酶抑制子的基因

蛋白酶抑制子是一類廣泛存在于植物中的蛋白質,是植物體內自然存在的病程相關蛋白,當植物受到病原侵襲時這些基因被激活從而賦予植物自然抵抗能力[25],其主要通過抑制參與致病過程的外來病原的蛋白酶或消化酶活性,從而導致病原缺乏必需氨基酸的供應而達到抗病的目的[26]。利用蛋白酶抑制子基因,特別是源自植物的抑制子基因進行基因轉移創(chuàng)造具有抗病蟲性的工程植株,具有廣闊的前景,如轉Vigna unguiculata的胰蛋白酶抑制子基因的煙草植株具有對病蟲的廣譜抗性[27]。目前自然界共發(fā)現(xiàn)4大類蛋白酶抑制劑[28]:絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。李廣存等[29]以馬鈴薯高抗青枯病基因型ED13為材料,利用cDNA-RGA方法獲得了Kunitz型蛋白酶抑制子基因片段,生物信息學的分析表明,該基因是馬鈴薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因家族的重要成員,進一步的半定量RT-PCR分析表明該基因受青枯病的誘導,推測可能參與了馬鈴薯的抗病防御。

2 RNAi技術的應用

RNAi(RNA干擾)技術是20世紀90年代中期發(fā)展起來的研究特定基因功能的新技術,具有定向、高效、快速、序列特異性強等優(yōu)點,已成功運用于植物、真菌和脊椎動物等生物體的功能研究中,并為植物基因功能研究提供了一條嶄新的思路。最初研究植物中RNAi現(xiàn)象的試驗是在馬鈴薯中通過PTGS(轉錄后基因沉默)誘導產生抗RNA病毒的能力及在水稻中使報告基因GUS沉默的能力來比較正義鏈、反義鏈及dsRNA誘導RNAi效率的高低,結果兩個試驗都得出同樣的結論,即dsRNA比正義鏈、反義鏈更能有效誘導目的基因的沉默[30]?，F(xiàn)在水稻和擬南芥的基因組測序已經完成,人們獲得了大量候選基因,同時其它植物的基因組測序和各種EST (Expression Sequence Tag) 的測序工作也正在進行。這些植物基因組和EST序列信息的獲得及測序技術的不斷提高使得人們迫切需要一種高效、高通量方法來研究植物基因的功能。RNA干擾技術為分析這些基因功能提供了一種快速、高效的途徑,并已取得大量進展[31,32]。此外,Fairbaim等[33]構建了根結線蟲(Meloidogyne javanica)靶基因MjTisl1不同發(fā)夾結構的RNAi質粒,通過農桿菌介導法轉入煙草植株,獲得表達不同hpRNA結構的轉基因植株。結果表明,寄生于轉基因煙草植株的線蟲體內的MjTisl1基因被持續(xù)沉默,而且這種基因沉默是MjTisl1特異的,線蟲體內其它不相關的基因序列不受任何影響。該研究證實了通過在寄主植株中表達靶基因dsRNA能夠沉默根結線蟲的相應基因。這種方法不僅可用于抗寄生線蟲的研究,也適合其它以食植物為生的害蟲。在植物和線蟲中,RNA沉默也能產生通過細胞邊界相互傳遞的系統(tǒng)信號[34]。該策略的應用有助于更好地理解植物寄生線蟲的功能基因組,更好地防治病原和可能的其它一些昆蟲病害。郭新梅等[35]用基因槍將構建好的sbeIIb RNAi表達載體pBAC413導入玉米(Zeamays)自交系中,對T1代轉基因玉米籽粒淀粉含量的測定結果表明:總淀粉含量與對照相比沒有顯著變化,但其中一個轉基因玉米株系的直鏈淀粉含量比對照提高了15.6%。為了鑒定我們所獲得的幾個馬鈴薯抗青枯病相關基因的功能,本實驗室分別利用馬鈴薯果膠甲脂酶抑制子基因(StPMEI)、蛋白酶抑制子基因(StPI)、類受體激酶基因(StRLK)及轉錄因子基因(StTF)的特異片段構建了RNA干擾表達載體,并進行了基因轉化,現(xiàn)已獲得了再生植株,再生植株的表型鑒定工作正在進行中。

3 農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化技術的研究進展

建立高效的植物再生轉化系統(tǒng),是遺傳轉化成功的前提和保障。農桿菌轉化法由于具有費用低、能轉移大片段DNA、外源基因拷貝數(shù)低并能穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點而備受青睞。農桿菌是從土壤中分離出來的革蘭氏陰性細菌,根據(jù)宿主范圍和致病癥狀可分為5種[36],其中研究最多也最透徹的是根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens),它能將自身Ti質粒的一段DNA(T-DNA)轉移到植物細胞中,從而使植物損傷部位形成冠癭瘤。由于T-DNA轉化不具有序列特異性,因此可用任何感興趣的基因來代替內源的T-DNA基因進行轉化[37]。自1983年首次通過農桿菌轉化獲得馬鈴薯再生植株至今,國內已獲得了不少的馬鈴薯品種轉化植株,如轉基因中薯1號、中薯3號、東農303、大西洋、費烏瑞它、布爾班克、黃麻子等,并得到了一些抗晚疫病、青枯病及抗旱的轉基因植株[38～40]。在外植體的選擇、不同轉化條件等方面人們也進行了大量探索,并建立了多種遺傳轉化體系。本實驗室在研究青枯病抗性相關基因的功能時,也建立了二倍體馬鈴薯基因型ED13和ED25的高效遺傳轉化體系,并獲得了多個馬鈴薯抗青枯病相關基因的轉基因再生植株,為進一步驗證這些基因的功能奠定了基礎。

4 展望

LRR-RLKs同時具有胞外LRR區(qū)和胞內激酶區(qū)的結構特點,使其成為植物信號分子傳導研究領域的熱點,越來越多的研究資料表明,LRR-RLKs在植物的生長發(fā)育和防衛(wèi)反應中起著重要作用。但仍有很多問題尚未解決,如在所有被發(fā)現(xiàn)的LRR-RLKs中,只有擬南芥BRI家族和CLV1家族成員的生化功能和作用方式研究的較為透徹,絕大部分的LRR-RLKs的功能和作用方式還知之甚少。這可能是因為:(1)植物信號傳導的復雜性。網絡狀的信號傳導模式導致多條傳導途徑的交叉;(2)不同蛋白功能的互補,導致某個基因突變體表型的恢復,難以獲得該基因的正常功能。今后的研究必將加強對LRR-RLKs配體和下游信號分子的搜尋、鑒定和識別,致力于構建每一小段信號傳導鏈,為今后整個信號傳導途徑網絡的構建打下基礎。

果膠甲酯酶抑制劑除在植物果膠甲酯酶的活性調控方面發(fā)揮重要作用外,在果蔬汁加工業(yè)中也具有廣闊的應用前景。一般認為,果膠甲酯酶抑制劑對植物果膠甲酯酶的抑制作用為后轉錄調控[21]。在植物體中,已發(fā)現(xiàn)許多果膠甲酯酶同工型,但目前所獲得的果膠甲酯酶抑制劑的同工型還很少。隨著植物體內果膠甲酯酶抑制劑同工型的不斷發(fā)現(xiàn),對果膠甲酯酶活性調控機理的研究將不斷深入,這將進一步促進對植物成熟衰老過程的研究。

RNAi作為關閉特定基因功能的新技術,為基因功能的研究提供了一個快速、簡便的方法。它的發(fā)現(xiàn)激起了世界范圍內各個實驗室探索基因功能的興趣,成為研究基因功能的最有用的工具之一。RNAi技術的應用方興未艾,隨著植物資源的廣泛開發(fā),相信RNAi技術將為人類探索自然做出更大的貢獻。

農桿菌介導的遺傳轉化技術是一種應用較多的基因轉化方法。多年來人們一直致力于影響轉化率各個方面的研究,包括基因型、外植體、預培養(yǎng)時間、侵染和共培養(yǎng)時間、農桿菌菌株、載體以及篩選劑等。雖然已經獲得了一些高效的馬鈴薯遺傳轉化體系,但仍有許多問題亟待解決,如轉化率仍然不高、轉化受基因型的限制等,今后在此方面的探索將逐步增強,這些問題也將最終得到解決。

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