【摘 要】通過正交實驗篩選甘露聚糖肽產(chǎn)生菌甲型溶血性鏈球菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果表明，其最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖10.0﹪，蛋白胨3.0﹪，酵母膏7.0﹪，氯化鈉5.%。其甘露聚糖肽的產(chǎn)量可達(dá)90.0mg/100mL。

【關(guān)鍵詞】甘露聚糖肽；甲型溶血性鏈球菌；培養(yǎng)基；正交試驗

中圖分類號:S335 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1009-8283(2009)01-0091-02

甘露聚糖肽(Mannatide)是我國首創(chuàng)的生物反應(yīng)修飾物，曾用名多抗甲素(Polyactin A， PAA)，是從正常人咽喉部分離的甲型溶血性鏈球菌33#株的深層培養(yǎng)液中經(jīng)乙醇提取得到的一種α-甘露聚糖肽。2000年國家藥品監(jiān)督管理局更名為甘露聚糖肽。甘露聚糖肽具有吸附病原菌、為有益菌提供營養(yǎng)、調(diào)節(jié)免疫機能、結(jié)合霉菌毒素、改善營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收吸收等作用[1，2]。PAA目前大多數(shù)用于對人體的研究上，臨床及動物試驗證明，PAA有增強免疫功能與抗腫瘤功能。隨著抗生素作為飼料添加劑將被逐漸限制使用，甘露聚糖肽有很好的發(fā)展前景，特別是疾病多發(fā)而免疫力低下的幼畜、雛禽和奶牛上[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌種：甲型溶血性鏈球菌33#株，長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

1.1.2 培養(yǎng)基

試管液體菌種培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂0.5%，pH 7.2。每支試管裝量10mL，滅菌121℃，20min。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，牛肉膏0.5%氯化鈉1.0%，pH7.5。裝量40％，滅菌121℃，30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：本試驗選擇葡萄糖作碳源、蛋白胨、酵母膏作氮源，按正交設(shè)計表L9(34)安排試驗如表1，每種培養(yǎng)基中加氯化鈉0.5%，滅菌后調(diào) pH 7.2。用 500 mL搖瓶裝量200mL，滅菌121℃，30min。每種培養(yǎng)基三個重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將凍干管的菌種接入試管液體培養(yǎng)基中，在30℃下，培養(yǎng)18～24h，經(jīng)無菌考查和形態(tài)學(xué)鑒定合格后再接入新鮮肉湯培養(yǎng)基試管中，30℃培養(yǎng)18～24h，反復(fù)兩次。挑選生長旺盛、活力強、形態(tài)特征等符合要求的菌種，冰箱保存。

1.2.2 搖瓶種子的制備

將優(yōu)良的試管液體菌種，按0.2％的接種量在無菌條件下接入搖瓶培養(yǎng)基中，靜置37℃下，培養(yǎng)24h，鏡檢，長勢良好，無雜菌。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

按0.2％的接種量在無菌條件下接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置37℃下，培養(yǎng)65～70h。鏡檢，染色開始變淺，盤繞球鏈開始部分?jǐn)嗔?，還原糖、氨基氮消耗將盡時，水浴80℃30min滅活。分析檢測結(jié)果為三次重復(fù)的平均值。

1.2.4 檢測方法

（1）鏡檢：石碳酸復(fù)紅簡單染色，顯鏡鏡下觀察［5］。

（2）甘露聚糖的測定方法:分光光度法［6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化組合的確定

2.1.1 直觀分析

發(fā)酵液的甘露聚糖肽含量（PAA）的直觀分析結(jié)果見表2，比較各列的極差R值，可以看出影響多糖含量的因素中RC>RA>RB，即在試驗確定的因素中，酵母膏影響最大，葡萄糖其次，而蛋白胨影響最小。分別比較各個因素的K值，得到產(chǎn)甘露聚糖肽的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B1C3，從10%和15%葡萄糖比較，產(chǎn)物得率提高幅度較小，因此從經(jīng)濟(jì)角度考慮，葡萄糖取10%。最適的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖10%、蛋白胨3%、酵母膏7%、氯化鈉5%、pH7.2。

2.1.2 方差分析

方差分析結(jié)果見表3，由此可看出發(fā)酵培養(yǎng)基的三個因素中，對甘露聚糖而言，F(xiàn)酵母膏>F0.05， F葡萄糖>F0.05即酵母膏和葡萄糖影響都極顯著，但酵母膏影響最大，葡萄糖影響其次，蛋白胨影響最小。

2.2 結(jié)果驗證

試驗最佳培養(yǎng)基組合沒有出現(xiàn)在正交表中。按照上述分析得到的最佳實驗條件組合，進(jìn)行三次重復(fù)試驗。結(jié)果，甘露聚糖肽含量分別為90.05mg/100 mL、89.56mg/100mL、90.12mg/100mL 平均值為90.06 mg/100mL，從以上驗證試驗的數(shù)據(jù)可看出，所得數(shù)值均高正交表9組中的任一組試驗，即確定為最佳組合。

3 結(jié)論

在本實驗中通過三因素三水平的正交實驗選出了最適合菌株產(chǎn)甘露聚糖肽的培養(yǎng)基配方為葡萄糖15%、蛋白胨3%、酵母膏7%、氯化鈉5%、pH7.2。接種量2%，37℃靜置培養(yǎng)65~70h，發(fā)酵液中甘露聚糖肽的含量可達(dá)到90mg/100mL，提高了甘露聚糖肽產(chǎn)物的得率，達(dá)到了優(yōu)化培養(yǎng)基目的。

參考文獻(xiàn):

[1] 朱萬壽等．大劑量甘露聚糖膚對惡性淋巴瘤患者T細(xì)胞亞群及健康狀況影響的臨床研究．中國臨床藥理學(xué)雜志，2002，18(4)：274～176。

[2] 郭冬生，彭小蘭，司國立．免疫增強性多抗甲素的作用機理及其研究進(jìn)展獸藥與飼料添加劑．2003，8（2）：15～16。

[3] 李雷斌等．肉用仔雞添加“α-甘露聚糖膚復(fù)合預(yù)混料”的飼養(yǎng)效果研究．畜禽生產(chǎn)，

2005，NO.5:44～45。

[4] 梁琳琳，楊育芳，孫雪菊等．B群鏈球菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究．微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，32（3）：20～25。

[5] 趙斌，微生物學(xué)實驗，中國科學(xué)出版社

[6] 甘露聚糖肽注射液國藥準(zhǔn)字H22025032。

(責(zé)任編輯：晏歡)