王狄　張嘉楠

摘要：建立了使用Waters UPLC Xevo TQ超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測水產(chǎn)品中4種硝基呋喃代謝物的分析方法。勻漿后的樣品在酸性環(huán)境下水解，并用2一硝基苯甲醛衍生16h，經(jīng)磷酸氫二鉀提取，LMS固相萃取小柱凈化后，在三重四極桿多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行測定。方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，四種代謝物的檢出限（LOD）均低于0.25μg·kg^-1，線性范圍在0.5μg·L^-1到10μg·L^-1間，相關(guān)系數(shù)大干0.99。在0.5、1.0和5μg·kg^-1濃度下分別進(jìn)行添加回收試驗（n=5），回收率在75.2%～123.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于9.4%。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃代謝物；固相萃??；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；水產(chǎn)品

硝基呋喃類藥物（nitrofurans）主要是指呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）、呋喃它酮（furMta-done，AMOZ）、呋喃西林（nitrofurazone，SEM）、呋喃妥因（nitrofurantoin，AHD）等引入硝基的人工合成抗菌藥，近年來發(fā)現(xiàn)其具有慢性毒性，可引起消化道反應(yīng)，美國、歐盟等工業(yè)發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已禁止使用。硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)數(shù)小時內(nèi)可降解，但其代謝產(chǎn)物能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時間達(dá)數(shù)周之久，甚至在蒸煮、烘烤、磨碎和微波加熱過程中也無法有效降解，因此檢測硝基呋喃類藥物的代謝產(chǎn)物，更能起到監(jiān)控作用。目前歐盟對硝基呋喃類代謝物的檢測方法靈敏度規(guī)定為1μg/kg。

試驗采用了超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測硝基呋喃類藥物代謝物。在農(nóng)業(yè)部781號公告-4-2006的基礎(chǔ)上對樣品前處理過程進(jìn)行了簡化，并且采用固相萃取法對樣品進(jìn)行凈化，提高了工作效率和實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。經(jīng)過多次試驗證明方法的結(jié)果及穩(wěn)定性可靠，適用于日常水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的痕量檢測工作。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC Xevo TQ液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國沃特世）；雙功能氣浴恒溫振蕩器（江蘇天由有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；氮空氣吹掃濃縮儀（北京斯珀特科技有限公司）；CGX一274ASPEC四通道自動固相萃取儀（法國吉爾森）。

甲醇、乙腈、甲酸和正己烷均為色譜純；鹽酸為優(yōu)級純；磷酸氫二鉀為分析純；2-硝基苯甲醛（購自德國CNW公司）；所有標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)均購自德國Dr.Ehrenstorfer；Bond Elut LMS固相萃取小柱（200mg，3mL）。

1.2 樣品前處理

衍生化：稱取（2±0.05）g樣品于離心管中，加入100μg·L^-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，再加入0.1mol·L^-1鄰硝基苯甲醛100μL、0.2mol·L^-1的鹽酸5mL，漩渦混合30s后，于37℃恒溫箱中避光衍生16h。

提取：待樣品冷卻至室溫后，加入1mol·L^-1磷酸氫二鉀5mL，漩渦混勻，用1mol·L^-1氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2～7.4后，8000r/min離心10min。

凈化：將5mL樣品上清液加入到BondElutLMS固相萃取小柱中（使用前依次用3mL乙酸乙酯、甲醇和水活化），然后用3mL水淋洗、吹干，最后用3mL乙酸乙酯洗脫。洗脫液于40℃氮氣流下吹干，殘渣用1mL0.1%甲酸水溶解，過0.22μm微孔濾膜后上機(jī)測定。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×100 mm；進(jìn)樣量：5μL；流動相：A：0.1%甲酸水B：乙腈；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃

質(zhì)譜條件：

離子源：ESI；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；脫溶劑氣流量：650L/h；錐孔氣流量：50L/h；脫溶劑氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3kV；離子源：150℃；碰撞氣流量：0.18mL/min；正離子模式；其它參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

試驗在農(nóng)業(yè)部781號公告-4-2006前處理方法的基礎(chǔ)上加入了固相萃取凈化過程。由于乙酸乙酯較水極性小，所以在固相萃取過程中，極性較小的乙酸乙酯作為溶劑會一定程度上破壞非極性藥物和非極性吸附劑之間的非極性作用力。因此，在提取過程中簡化掉了藥物從水溶液到乙酸乙酯的轉(zhuǎn)移過程，同時降低了藥物在轉(zhuǎn)移過程中的損失，提高了回收率。

2.2 固相萃取小柱的選擇

BondElut LMS：是聚合物吸附劑，萃取機(jī)制為非極性，萃取化合物為非極性化合物，在洗脫樣品時無須再添加有機(jī)胺類改性劑、緩沖液或者酸等。次級相互作用的消除意味著使用純的有機(jī)溶劑或與HPLC流動相兼容的低離子強(qiáng)度的洗脫液即可洗脫目標(biāo)分析物。這種特性可以很好地保證萃取技術(shù)與LC/MS和其它高靈敏度的檢測技術(shù)的兼容性。優(yōu)選的吸附劑顆粒大小和大的比表面積保證了萃取效率，可以實現(xiàn)無干擾萃取。實驗參考了Alexander Leitner，Peter Zollner，Wolfgang LindnerE<對樣品的固相萃取凈化方法，并選擇了與其方法所用的固相萃取小柱填料相同的安捷倫Bond Elut LMS固相萃取小柱（200mg，3mL）。通過吉爾森四通道自動固相萃取儀對不同添加水平的樣品進(jìn)行固相萃取測定試驗，以及相同添加濃度的樣品分別進(jìn)行固相萃取和無固相萃取過程的對比試驗，結(jié)果表明，BondElutLMS固相萃取小柱能夠有效地去除樣品基質(zhì)中蛋白類基質(zhì)的干擾，并且能夠保證高的回收率和結(jié)果重現(xiàn)性。

2.3 方法的線性關(guān)系、精密度及準(zhǔn)確度

按照實驗的條件和方法，配置濃度分別為0.5、1、2、5、10μg·L^-1一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，用定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和內(nèi)標(biāo)濃度比做校正曲線，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及最低檢出限見表3。通過空白基質(zhì)加標(biāo)，并按照S/N=3計算方法檢出限。結(jié)果表明，4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.05-0.2μg·kg^-1。

2.4 加標(biāo)回收及精密度實驗

實驗選用大菱鲆、草魚、對蝦為基質(zhì)，分別采用0.5、1.0和5μg·kg^-1三個加標(biāo)水平，計算平均回收率和精密度（n=5），結(jié)果見表4?；Ч茫軌?qū)λa(chǎn)品中的硝基呋喃代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。

（收稿日期：2016-05-16；～回日期：2016-05-23）