文章編號(hào)：1008-6919（2007）09-0098-02中圖分類號(hào):R817.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A【基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)】

【摘要】 目的 應(yīng)用單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的體外模型，研究單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞細(xì)胞分化過程中基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)及其活性的變化.方法用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA) 孵育THP-1細(xì)胞不同時(shí)間，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，RT-PCR觀察MMP-9 mRNA表達(dá)的變化，Western blot觀察MMP-9蛋白表達(dá)的變化，明膠酶譜(gelatin-zymogram)分析法測定MMP-9活性的變化。結(jié)果THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA孵育后， 細(xì)胞由分散、懸浮轉(zhuǎn)變?yōu)轲じ?、貼壁， 且MMP-9的表達(dá)明顯上調(diào)，活性增加.結(jié)論 單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的過程中，MMP-9的表達(dá)量及其活性明顯增加。

關(guān)鍵詞：PMA 單核細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 基質(zhì)金屬蛋白酶9

1 前言

MMP－9 是明膠酶的一種，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、以及內(nèi)皮細(xì)胞等均有表達(dá)[1]，參與降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），在多種生理和病理過程中起著重要作用。為此，我們采用單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的體外模型，探討單核細(xì)胞在分化為巨噬細(xì)胞的過程中MMP-9表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

2 材料和方法

2.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心。含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至106/ml時(shí)換無血清培養(yǎng)基，加PMA（至終濃度為100nM）[2]，分別孵育6、12和24小時(shí)。

2.2 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達(dá)[3]

用TRIZOL RNA抽提液提取細(xì)胞總RNA，RNA濃度以紫外分光光度計(jì)(美國PE公司Lambda25型)重復(fù)測量3次，A260nm/A280nm比值在1.8以上方可用。取1.0μg總RNA為模板，以O(shè)ligo（dT）16為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為65℃變性5min，42℃反應(yīng)50min，70℃終止反應(yīng)15min。擴(kuò)增MMP-9的引物為：有意義序列引物5’-CGGGACGGCAATGCTGATG-3’，反義序列引物5’-CGCCACGAGGAACAAACTGT-3’， 預(yù)計(jì)擴(kuò)增引物全長為362bp。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）為內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增GAPDH引物為：有意義引物序列5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’， 5’ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧ 3’，下反義序列引物:5’ＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＧ 3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增引物全長為697bp，均由上海生工合成。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL分別進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火45s，72℃延伸1min。退火溫度SDF-1為58℃，GAPDH為58℃。經(jīng)28個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。取5μL聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳。并利用凝膠成像系統(tǒng)作結(jié)果分析。

2.3 Western blot 檢測MMP-9蛋白表達(dá)

經(jīng)8%SDS-PAGE分離樣品蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移緩沖液在200mA、100V條件下電泳6h后轉(zhuǎn)膜，洗膜，封閉液封閉。分別加入一抗，4℃輕輕振蕩約2h，漂洗，加過HRP標(biāo)記的二抗雜交，再漂洗，顯色液顯色，暗室中感光，拍照并進(jìn)行灰度掃描測定。

2.4 明膠酶譜法測定MMP-9活性[4]

酶原電泳在含0.1%明膠、10%SDS的8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行。電泳完畢后，將凝膠浸入2.5%Triton-100中復(fù)性30min，共2次，洗去SDS，恢復(fù)MMP-2、MMP-9活性。再將凝膠浸入酶解緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，pH 7.6、0.2mol/L NaCl、5mmol/LCaCl2、0.02%Brij35），溫育37℃ 18小時(shí)。用0.5%考馬斯亮蘭（10%冰醋酸、40%甲醇配制）染色90min后，10%冰醋酸、40%甲醇脫色至透明條帶與蘭色背景對(duì)比清晰即可。凝膠掃描，半定量測定MMP-9活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±S)表示。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩均數(shù)間的多重比較，采用Student t檢驗(yàn)，P<0.05為差異達(dá)到顯著水平。

3 結(jié)果

3.1 PMA處理對(duì)THP-1細(xì)胞形態(tài)的影響

THP-1細(xì)胞和PMA孵育6h后，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生改變，由懸浮型轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁型，到24h時(shí)，基本貼璧，但細(xì)胞外型依然為圓形，細(xì)胞表面伸出偽足，細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡。

3.2 PMA對(duì)THP-1細(xì)胞 MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，在單核細(xì)胞中有MMP-9 mRNA基礎(chǔ)表達(dá)，在經(jīng)PMA孵育后，隨著孵育時(shí)間的延長，MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯增加。

3.3 PMA對(duì)THP-1細(xì)胞 MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與RT-PCR檢測結(jié)果基本一致，在單核細(xì)胞中即有MMP-9蛋白表達(dá)，在經(jīng)PMA孵育后，隨著PMA孵育時(shí)間的延長，MMP-9蛋白表達(dá)量明顯增加，到6h時(shí)，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P<0.05）。

3.4 PMA對(duì)THP-1細(xì)胞 MMP-9活性的影響

用含明膠的SDS-PAGE 對(duì)培養(yǎng)液上清中的MMP-9活性檢測結(jié)果表明，在經(jīng)PMA孵育后，在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的過程中，MMP－9的活性明顯增加。

4 討論

循環(huán)血液中的單核細(xì)胞在黏附分子和單核細(xì)胞趨化蛋白的作用下，黏附于血管內(nèi)皮，再穿過內(nèi)皮細(xì)胞間連接遷入內(nèi)皮下間隙。進(jìn)入內(nèi)皮下間隙的單核細(xì)胞被激活，分化為巨噬細(xì)胞。Shigeru等證實(shí)在將單核細(xì)胞與PMA孵育24小時(shí)后轉(zhuǎn)化為成熟的巨噬細(xì)胞，為良好的體外單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞細(xì)胞模型。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們也觀察到單核細(xì)胞與PMA孵育后，到6h時(shí)，細(xì)胞表型即發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞開始貼璧，到24h時(shí)，細(xì)胞幾乎完全貼璧，并且細(xì)胞體積增大，細(xì)胞邊緣伸出偽足，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，形成巨噬細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

在AS 損傷中，富含脂質(zhì)的巨噬源性泡沫細(xì)胞聚集是易破斑塊的重要特征，其中病灶區(qū)MMP－9表達(dá)的增加可能在斑塊破裂中起重要作用 [5]。對(duì)AS 高膽固醇血癥的家兔模型的動(dòng)脈損傷處分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這種明膠水解活性酶主要來源自巨噬源性泡沫細(xì)胞。我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞過程中，尚未形成泡沫細(xì)胞，MMP-9的表達(dá)量與活性即有明顯上調(diào)。因此我們推測在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的過程中，MMP－9的表達(dá)及活性增加，一方面增加ECM的降解，從而有利于平滑肌細(xì)胞的遷移，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展，另一方面加速斑塊中膠原的降解，從而降低斑塊的強(qiáng)度，促使斑塊破裂。

綜上所述，在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞過程中，MMP-9表達(dá)量及活性的改變，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展以及斑塊的穩(wěn)定性起著重要的調(diào)節(jié)作用。

參考文獻(xiàn)

1王梅芳，楊林花. MMP-9 與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化. 臨床心血管病雜志. 2004，20 （11 ）：699－701.

2周筠， 朱平， 蔣建利， 等. PMA誘導(dǎo)的THP21細(xì)胞分化過程中MMP29及MMP22的表達(dá)與細(xì)胞侵蝕性的關(guān)系. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2005， 21 (2)：256－257.

3呂運(yùn)成，王佐，危當(dāng)恒，等. 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α—CXCR4趨化THP-1細(xì)胞遷移及氧化型低密度脂蛋白的影響. 中國動(dòng)脈硬化雜志. 2007，15（1）：15－18.

4危當(dāng)恒，萬臘香，劉錄山，等. 阻斷清道夫受體AI對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑表達(dá)的影響. 中國動(dòng)脈硬化雜志. 2003，11（2）：111－114.

5Papaspyridonos M， Smith A， Burnand KG， et al. Novel candidate genes in unstable areas of human atherosclerotic plaques. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006 ，26(8):1837-44.