文章編號：1008-6919（2007）09-0148-03中圖分類號:R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A【醫(yī)藥管理】

【摘要】 目的 建立一種檢測保健食品及中成藥中非法摻加化學(xué)降糖藥物的篩查方法。 方法采用TLC法對保健食品和中成藥非法摻加化學(xué)降糖藥物進(jìn)行初步定性，然后用HPLC法進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)建立的條件能夠把保健食品及中藥制劑中添加的降糖化學(xué)藥物（格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲）同時(shí)完全分離開來；對18種制劑用建立的分析技術(shù)進(jìn)行了檢測，經(jīng)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，得到有 8種保健食品和中成藥中非法摻有降糖化學(xué)藥品，1種食品中非法摻入了降糖化學(xué)藥品。結(jié)論 該研究建立的方法具有快速、簡便、重復(fù)性好、便于操作、靈敏、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：TLC HPLC 保健食品 中成藥 化學(xué)降糖藥物

我國食品和藥品市場上出現(xiàn)了在降糖保健食品和中成藥添加格列本脲、格列齊特等化學(xué)藥，面對此類的違法行為，光憑肉眼很難識別，必須通過現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)的檢測才能識別，現(xiàn)有單一的薄層色譜法、紫外分光光度法或HPLC法，已很難滿足檢測的要求，尤其是干擾成分多且量少的情況。雖然現(xiàn)有HPLC-MS法可以解決此類問題，但儀器太昂貴，基層單位很難擁有，故本文作者根據(jù)實(shí)際需要，建立了TLC結(jié)合HPLC法這種專屬性強(qiáng)、靈敏度高且基層適用的檢測技術(shù)，有很大的實(shí)際應(yīng)用意義。

1 儀器與試藥

1.1試藥

格列本脲對照品（批號：10135-200404），格列齊特對照品（批號：0269-9701），格列吡嗪對照品（批號：100281-0001），格列喹酮對照品（批號：100280-200301），格列美脲對照品（批號：100674-200301）。以上均購自中國藥品生物制品檢定所。

降糖中成藥制劑S1，S2，S3，S4，S5、S6，S7 、S8、S9、S10。降糖食品S11，S12，S13，S14，S15、S16，S17 、S18。以上樣品均為市售品。

甲醇（色譜純 ），乙腈（色譜純 ），乙酸銨、石油醚（60～90℃）、無水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷，均為分析純，硅膠GF254預(yù)制板（200×200mm，青島海浪硅膠干燥劑廠，批號20061012）

1.2儀器Waters高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，ThermoTM C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。ZF-I型三用紫外分析儀，TLC SCANNER3薄層色譜掃描儀（瑞士CAMANG公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1對照品溶液的配制分別精密稱取格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲對照品各約5 mg，加三氯甲烷5 ml使其溶解，備用。

2.1.2樣品溶液的配制分別取各樣品的一次口服劑量，研細(xì)，分別置100 ml錐型瓶中，各加三氯甲烷30 ml，超聲30分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? ml使其溶解，備用。

2.1.3 薄層板：硅膠GF254預(yù)制板（200×200mm，青島海浪硅膠干燥劑廠，批號20061012，厚0.3mm）臨用前110 ℃活化30分鐘。

2.1.4點(diǎn)樣量：取上述溶液各5μl。

2.1.5展開劑：石油醚-乙酸乙酯-三氯甲烷-無水乙醇-甲酸（10：5：2：1：0.1）。

2.1.6展開方式：預(yù)飽和15分鐘，上行展開，展距：18cm，溫度：：22 ℃， 相對濕度：75%。

2.2結(jié)果

2.2.1薄層檢識結(jié)果 取出，晾干，置紫外燈254nm下，檢識，得到保健食品S12和中成藥S6，S8的色譜圖中在與格列本脲和格列齊特對照品相應(yīng)的位置上顯相同的斑點(diǎn)；保健食品S17的色譜圖中在與格列美脲和格列齊特對照品相應(yīng)的位置上顯相同的斑點(diǎn)；保健食品S13，S15、S18和中成藥S5，S7的色譜圖中在與格列本脲對照品相應(yīng)的位置上顯相同的斑點(diǎn)，具體圖譜見圖1。

圖1 （從左到右編號） 1-格列本脲對照品 2-格列吡嗪對照品 3-格列喹酮對照品 4-格列美脲對照品 5-格列齊特對照品6，7-混合對照品8-樣品S13 9-樣品S15 10-樣品S18 11-樣品S1712-樣品S12 13-樣品S6 14-樣品S8

Fig 1 1- Glibenclamide，2- Glipizide3- Gliquidone4- Glimepiride5- Gliclazide 6，7-the mixture 8- the sample S13 9- the sample S1510- the sample S1311- the sample S1712- the sample S12 13- the sample S6 14- the sample S8

2.2.2薄層掃描結(jié)果取上述薄層板在薄層掃描儀上掃描得到圖譜，結(jié)果與上述一致，具體圖譜見圖2。

圖2 A ：格列本脲、格列齊特、格列喹酮、格列吡嗪、格列美脲混合對照品的TLC掃描圖

B：陰性樣本食品S11的TLC掃描圖C：中成藥S8的TLC掃描圖D：食品S17的TLC掃描圖

Fig 2A ：Chromatograms of Glibenclamide，Gliclazide，Glipizide，Gliquidone，Glimepiride

B ：Chromatograms ofthe blank C：Chromatograms ofthe sample D: Chromatograms ofthe food

3HPLC法的定量測定

3.1 對照品溶液的配制分別精密稱取格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲對照品各約25 mg，分置50 ml的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

3.2樣品溶液的配制

3.2.1 樣品溶液的配制分別取樣品各10粒（片），精密稱定，取內(nèi)容物粉末[約相當(dāng)于1粒（片）]分別置25 ml容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，備用。

3.2.2陰性溶液的配制取陰性樣品10粒，精密稱定，取內(nèi)容物粉末（約相當(dāng)于1粒）置25 ml容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，備用。

3.3色譜條件采用Thermo C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）， 柱溫：30 ℃，

流動相：乙腈-20 mmoL· L-1乙酸銨溶液（+0.1%乙酸），梯度洗脫程序?yàn)椋海?0:60～50:50， 0～5 min ），(50:50～55:45，5～15min)，(55:45～50:50，15～40min)，(50:50～40:60，40～60 min)，流速：1.0 ml·min -1， 檢測波長：235 nm，進(jìn)樣量：20μl。

3.4最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇

3.4.1檢測波長的選擇取上述各對照品母液加甲醇稀釋成約10μg·ml-1的溶液，在190 nm～370 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測得格列本脲、格列齊特、格列喹酮、格列吡嗪的最大吸收波長為235 nm左右。故本實(shí)驗(yàn)選擇235 nm作為檢測波長，以便同時(shí)測定上述5種藥物。

3.4.2流動相的選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別配制了5 mmoL·L-1庚烷磺酸鈉溶液-乙腈、5 mmoL·L-1四丁基溴化銨溶液-乙腈、50 mmoL·L-1磷酸二氫鉀溶液-乙腈、20mmoL·L-1乙酸銨溶液（+0.1%乙酸）-乙腈、20mmoL·L-1枸櫞酸鹽緩沖液－乙腈、20mmoL·L-1乙酸胺溶液-0.1%的乙酸－乙腈、0.5%醋酸－乙腈、0.5%醋酸－乙醇－乙腈，在本研究中考察了上述流動相對各物質(zhì)色譜行為的影響，發(fā)現(xiàn)5 mmoL·L-1庚烷磺酸鈉溶液-乙腈、5 mmoL·L-1四丁基溴化銨溶液-乙腈分別作為流動相時(shí)，其色譜峰拖尾，有很多雜質(zhì)峰，且在室溫低的時(shí)候容易出現(xiàn)渾濁；50 mmoL·L-1磷酸二氫鉀溶液-乙腈、30 mmoL·L-1醋酸銨溶液-乙腈分別作為流動相時(shí)，各物質(zhì)色譜峰峰形好，且能夠完全分離開來，但為了保護(hù)柱子，因有磷酸鹽的流動相，故選擇20 mmoL·L-1乙酸銨溶液（+0.1%乙酸）-乙腈作為流動相。

3.4.3 流速的影響 考察了0.8 ，1.0 ，1.2ml·min -1三個(gè)流速，流速太小，出峰時(shí)間長且拖尾嚴(yán)重，色譜峰擴(kuò)寬；流速太大，各組分保留時(shí)間均減小，導(dǎo)致峰分離不好，尤其是替硝唑和塞克硝唑分離不好，故本研究選用出峰時(shí)間和峰形較理想的流速為1.0ml·min -1。

3.4.4柱溫的影響 考察了20，30，40，50 ℃四種溫度，溫度越高，出峰越快，且柱效高，但高于30℃后變化不明顯，但溫度太高對色譜柱不利，故本研究柱溫設(shè)定為30 ℃。

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5.1 HPLC色譜分離情況取上述各對照品母液加甲醇分別配制成約20μg·ml -1的溶液及其混合液濃度為20 μg·ml -1，依選定的色譜條件，上機(jī)進(jìn)行分析，記錄色譜圖，在選擇好的實(shí)驗(yàn)條件下，格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲5種藥物與干擾完全分開，且峰形良好，其保留時(shí)間（tR）分別為：24.8 min，16.9min，12.1min，37.7min，26.7min。具體色譜圖見圖3。

圖3A ：格列本脲、格列齊特、格列喹酮、格列吡嗪、格列美脲混合對照品的HPLC圖

B ：中成藥糖膠囊S5的HPLC圖 C ：陰性樣品S1的HPLC圖D:食品樣品S12的HPLC圖

Fig 3A ：Chromatograms of Glibenclamide，Gliclazide，Glipizide，Gliquidone，Glimepiride

B ：Chromatograms ofthe sampleC :Chromatograms ofthe blankD: Chromatograms ofthe food

3.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取上述對照品溶液各1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml分置50ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述選擇好的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積（A）對濃度（C）進(jìn)行線性擬合，得到格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲的回歸方程分別為： A格列本脲= 1.11×105 C－3.85×105，r=0.9993，（n=3）;A格列齊特= 0.71×105 C－5.15×105，r=0.9998，（n=3）; A格列吡嗪= 0.90×105C－2.90×105，r=0.9993，（n=3）; A格列喹酮= 9.38×104 C+0.66×104，r=0.9993，（n=3）; A格列美脲= 7.18×104 C+0.72×104，r=0.9995，（n=3）;線性范圍分別為：12.50～62.50μg·ml -1，8.40～42.00 μg·ml -1，13.28～66.40μg· ml -1，9..96～49.80 μg·ml -1， 8.96～44.80 μg·ml -1。

3.5.3 最低檢測限的確定根據(jù)檢出限（S/N≥3）定義為產(chǎn)生相應(yīng)于三倍背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)差分析信號的分析物濃度值。據(jù)此定義計(jì)算出格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲的檢出限分別為0.160 ，0.641 ，0.071，0.085，0.102μg。

3.5.4精密度考察 取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下濃度為30 μg·ml -1的對照品溶液進(jìn)樣分析，每天處理5份數(shù)據(jù)，連續(xù)做3 d，求得其日內(nèi)日間的RSD，具體見表1。

3.5.5重復(fù)性試驗(yàn)取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下濃度約為30μg·ml -1的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，其峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.9%，2.1%，2.9%，1.1%、1.2%。

3.5.6 回收率實(shí)驗(yàn)精密量取上述配制好的陰性中成藥膠囊S4溶液3 ml置50 ml容量瓶中，再精密加入上述配制好的對照品溶液各2.0 ，3.0 ，4.0 ml分置上述50 ml容量瓶中（各平行試驗(yàn)5份），加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出各自的回收率，具體見表2。

3.5.7樣品測定結(jié)果采用上述選擇好的色譜條件，取配制好的對照品溶液和樣品溶液上機(jī)進(jìn)行分析，記錄色譜圖，根據(jù)外標(biāo)法，求出其含量，結(jié)果見表3。

4討論

4.1 采用三氯甲烷作為溶劑時(shí)，提取較完全且干擾物質(zhì)少。

4.2選擇石油醚-乙酸乙酯-氯仿-無水乙醇-甲酸（10：5：2：1：0.1）為最佳展開劑。

4.3HPLC法試驗(yàn)中樣品提取的溶劑的選擇，分別采用了甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇－氯仿（1：1），通過實(shí)驗(yàn)得到，當(dāng)溶劑采用甲醇時(shí)，其萃取率最好（95%）且峰型最好，故選用甲醇作為溶劑。

4.4 本試驗(yàn)建立的實(shí)驗(yàn)條件可以把格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲在同一色譜條件下同時(shí)完全分離開來，為檢測中成藥中是否非法加入這5種化學(xué)藥品，奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，為保障人們的用藥安全，將會有很大的實(shí)際應(yīng)用意義。同時(shí)對本試驗(yàn)檢測所得的陽性樣本用HPLC-MS進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果液相色譜法和用質(zhì)譜法檢測的結(jié)果一致，說明該法具有良好的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

1黃瑛，易秋艷，楊蕾等.格列美脲膠囊有關(guān)物質(zhì).檢查方法的研究[J].藥物分析雜志，2003， 23(5):351.

2王澤民，康葵，馮梅.當(dāng)代結(jié)構(gòu)藥物全集[M].北京科學(xué)技術(shù)出版社，1993，7月： 1962；1965.

3《中國藥典》2005年版二部[S]：594-599.

4劉會臣.國產(chǎn)格列齊特片的相對生物利用度研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1995，26（2）：63.

5董宇，孔璋，鐘大放.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測中藥降糖制劑中非法摻入的苯乙雙胍和格列本脲[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(1):19.

6孫玉明，孫苓苓，鐘大放.液相-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測某些中藥制劑中的格列本脲[J].藥物分析雜志，2005，25(3):326.