【摘要】 目的 探討白英提取物(Solanum lyratum Thunb extract，STE)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因survivin和caspase-3表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，以2.5、5、10 mg/L STE處理MCF-7細(xì)胞48小時(shí)，并以2.5 mg/L順鉑(DDP)作為陽性對(duì)照。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，TUNEL法檢測(cè)凋亡率，半定量RT-PCR檢測(cè)survivin和caspase-3 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，STE各濃度組細(xì)胞抑制率顯著上升(P<0.001)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001)，caspase-3 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.001)，survivin mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 STE具有誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用，其分子機(jī)制可能與上調(diào)caspase-3及下調(diào)survivin基因表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 白英；MCF-7細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；survivin； caspase-3

文章編號(hào)：1003-1383(2007)04-0357-03

中圖分類號(hào)：R 737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Apoptosis-inducing Effect of Solanum lyratum Thunb Extract on Human Breast

Cancer MCF-7 Cells and the Expression of Apoptosis Associated Genes

WEI Xing，LI Chao-gan，NONG Song

(Department of Microbiology，Youjiang Medical College for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)

【Abstract】 Objective To explore the apoptosis-inducing effect of Solanum lyratum Thunb extract(STE) and the expression of apoptosis associated genes survivin and caspase-3 on human breast cancer MCF-7 cells.Methods MCF-7cells were treated with 2.5，5 and 10 mg/L STE for 48 h， and the cells were treated with 2.5 mg/L DDP as positive control. The inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Apoptotic rate was determined by TUNEL method. The expression of survivin and caspase-3 mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR.Results Compared with control group， the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001)， the apoptotic rate was increased markedly(P<0.001)， the expression of caspase-3 mRNA was increased significantly(P<0.001)， while survivin mRNA was decreased markedly (P<0.05 or P<0.01) in STE groups.Conclusion STE can induce MCF-7 cells apoptosis. The molecular mechanism might be related to up-regulating expression of caspase-3 and down-regulating expression of survivin genes.

【Key words】 Solanum lyratum Thunb； MCF-7 cells； apoptosis； survivin； caspase-3

白英(Solanum lyratum Thunb，ST)為茄科植物，又稱白毛藤，是常用的抗癌中草藥，在臨床上多用于治療肺癌、子宮頸癌、食道癌、乳腺癌和肝癌等多種癌癥^[1]。研究證實(shí)，ST提取液能通過上調(diào)fas基因和下調(diào)fasL基因表達(dá)，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡^[2]。生存素(Survivin)是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其主要通過抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的caspase-3和caspase-7活性，從而抑制細(xì)胞凋亡^[3]。本研究通過觀察ST提取物(STE)誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡作用，并檢測(cè)凋亡相關(guān)基因survivin 和caspase-3 mRNA表達(dá)情況，以探討ST抗乳腺癌作用及其初步分子機(jī)制。

材料和方法

1.材料 乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫提供，胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為上海普飛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，PCR引物為上海生物工程公司合成。KHB-Labsystems K₃酶標(biāo)儀為芬蘭雷勃公司生產(chǎn)，BX51型顯微鏡為日本OLYMPUS公司生產(chǎn)，PCR儀為杭州郎基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

2.方法

(1)藥物提取 取ST(購買于百色市中醫(yī)院中藥房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，溫度40℃，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥得ST浸膏，二甲基亞楓(DMSO)溶解浸膏樣品配制成濃度為10 mg/ml提取物藥液， 再以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度供實(shí)驗(yàn)用。

(2)實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理 體外按常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(即不加藥物處理)、STE處理組(濃度分別為2.5、5、10 mg/L)和DDP組(濃度2.5 mg/L)；更換含0(正常對(duì)照組)、2.5、5、10 mg/L STE和2.5 mg/L DDP的新鮮培養(yǎng)液，藥物作用時(shí)間均為48 h。

(3)細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTT法) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度約為1×10⁴個(gè)/ml，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入含STE的10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液200 μl，每個(gè)藥物濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，另設(shè)DDP為陽性對(duì)照組和空白對(duì)照孔。培養(yǎng)到44 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震蕩混合儀震蕩10 min。選擇492 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔光吸收值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

(4)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡檢測(cè)步驟按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。藥物作用后，收集各組細(xì)胞，用PBS漂洗兩遍后進(jìn)行細(xì)胞涂片，風(fēng)干后丙酮固定15 min；細(xì)胞在滲透液(0.2%Triton X-100，0.1%檸檬酸鈉)中孵育5 min，雙蒸水沖洗玻片；滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37℃濕盒中孵育30 min；滴加轉(zhuǎn)化劑-POD，37℃濕盒中孵育30 min，沖洗玻片；滴加DAB底物溶液，室溫5~10 min；蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、封片；以不加TUNEL反應(yīng)混合液作為陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕黃色為TUNEL反應(yīng)陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)。光鏡下分析結(jié)果，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)即為細(xì)胞凋亡率。

(5)半定量RT-PCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá) 藥物處理細(xì)胞后，按Trizol試劑盒的說明書提取總RNA。Survivin，caspase-3和內(nèi)對(duì)照β-actin引物借助primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)Genebank驗(yàn)證(見表1)。按試劑盒說明采用一步法進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)體系總體積50 μl，逆轉(zhuǎn)錄45℃×45 min，AMV RT滅活和預(yù)變性94℃×2 min，然后進(jìn)行PCR 35個(gè)循環(huán)(94℃×30 s，57℃×1 min，68℃×2 min)，最后延伸68℃×7 min， 終止于4℃。各取PCR產(chǎn)物10 μl，加溴酚藍(lán)指示劑2 μl，于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳約1 h(電壓90伏)，用紫外透射分析儀觀察結(jié)果并拍照。通過密度掃描儀掃描分析各條帶的光密度，以β-actin的表達(dá)量為對(duì)照計(jì)算并比較各組survivin和caspcse-3的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果

1.各組MCF-7細(xì)胞抑制率、凋亡率的比較 STE各濃度組及DDP組的細(xì)胞抑制率、凋亡率均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001)。表2。

2.各組MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，STE各濃度組細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01或P<0.05)，caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯上升(P<0.001)。見表3。

討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STE對(duì)MCF-7細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(STE濃度與抑制率、凋亡率呈現(xiàn)正相關(guān)，兩者γ值分別為0.9831和0.9379)。提示一定濃度的STE對(duì)MCF-7細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷能力并能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是其抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一。

Survivin抗凋亡作用已被研究證實(shí)，它不僅通過阻斷線粒體細(xì)胞色素C釋放，與下游凋亡效應(yīng)因子Caspase-3和Caspase-7結(jié)合而對(duì)其活性產(chǎn)生直接抑制效應(yīng)，而且還通過與紡綞體纖維的結(jié)合，間接抑制Caspase對(duì)紡綞體的水解作用，有利于保護(hù)有絲分裂細(xì)胞的完整性，從而抑制細(xì)胞凋亡^[4]。另外，Survivin與細(xì)胞周期素依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4， CDK4)形成Survivin- CDK4復(fù)合體，釋放出P21，而P21能進(jìn)一步與線粒體Caspase-3結(jié)合，抑制其活性，阻止細(xì)胞凋亡^[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，STE能下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，提示STE誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與下調(diào)survivin基因表達(dá)有關(guān)。

Caspase-3是Fas/Apo-1介導(dǎo)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，又是多種凋亡途徑共同作用的因子，其表達(dá)水平的高低決定著細(xì)胞凋亡程度^[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，STE能使乳腺癌MCF-7細(xì)胞caspase-3 mRNA表達(dá)增高，提示其對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)可能是通過caspase-3激活而發(fā)揮作用。

綜上所述，我們認(rèn)為STE誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與上調(diào)caspase-3及下調(diào)survivin基因表達(dá)有關(guān)。但Survivin和caspase-3基因在STE誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡中的關(guān)系如何，其他基因是否參與等方面，尚待深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]吳婉瑩，高志剛，李云谷，等.白英和歐白英的化學(xué)成分與藥理活性[J].國外醫(yī)藥植物藥分冊(cè)，2001，16(6)：245-247.

[2]韋 星，李朝敢，農(nóng) 嵩，等.白英提取液對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及Fas/FasL基因表達(dá)的影響[J].中藥材，2006，29(11)：1203-1206.

[3]Lacasse EC，Baird S，Korneluk RG，et al.The inhibitors of apoptosis(IAps) and their emerging role in cancer[J].Oncogene， 1998，17(25)：3247-3259.

[4]Andrade F，Roy S，Nicholoson D.et al.Granzyme B directly and efficiently cleaves sereral downstreem caspase substrates：implication for CTL-induced apoptosis[J].Immunity，1998，8(4)：451-460.

[5]Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10)：1346-1353.

[6]Tormanen，Napankangas U.Expression of Caspase-3，-6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell lung carcinoma[J].International journal of cancer，2001，93(2)：192-198.

(收稿日期：2007-05-22 修回日期：2007-07-12)

(編輯：梁明佩 英文審校：唐雄林)

“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文”