摘要: 霜霉病是世界上危害瓜類作物的主要葉部病害之一。霜霉病菌小種分化問題雖然在國際上還存在爭議， 但在國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)小種分化現(xiàn)象。文章歸納了不同的霜霉病抗性鑒定方法; 報道了不同黃瓜材料對霜霉病的抗性與其葉片生理生化物質(zhì)含量變化關(guān)系的最新研究進展; 介紹了對黃瓜霜霉病抗性遺傳規(guī)律研究主要的2 個結(jié)果: 多基因抗性和單隱性基因抗性; 概述了黃瓜霜霉病分子標記研究現(xiàn)狀和挖掘、利用黃瓜近緣野生種抗霜霉病基因的最新進展。

關(guān)鍵詞: 黃瓜; 霜霉病; 抗性

Progr ess on downy mildew r esistance in cucumberCAO Qing- he1， 2， WAN Hong- jian1， CHEN Jin- feng1

1. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing，Jiangsu， 210095， China; 2. Xuzhou Sweet Potato Research Center， Institute of Sweet Potato， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xuzhou， Jiangsu， 221121， China)

Abstr act: Downy mildewis a major foliage disease of cucurbit crops in the world. Though the researches on pathogen racesdifferentiation display different results between different nations， the phenomenon is now not found in China. This paperreviewed different the identification techniques of the disease. The new progresses were reported that the relations betweenresistance level in different accessions and the content of physiology- biochemical substance in each accession’s leaves.Resistance genetic regulation to downy mildew mainly lay in two results: multiple gene resistance and single recessive generesistance. Molecular markers of resistance to downy mildew in cucumber were reported， and the new proceedings of discoveringand utilizing resistance gene of relative wild species of cucumber was also done.Key words: Cucumber; Downy mildew; Resistance

黃瓜霜霉病是由古巴假霜霉病菌[Pseudoperonosporacubensis (Berk. Curt.) Rostov] 引起的， 俗稱“跑馬干”、“黑毛”等， 是世界范圍內(nèi)黃瓜產(chǎn)區(qū)主要葉部病害之一[1， 2]。在美國北卡羅來納州， 霜霉病的發(fā)生率為30%， 造成的經(jīng)濟損失占整個黃瓜產(chǎn)值的2.9%[3]。在我國， 霜霉病與白粉病、枯萎病并列為黃瓜三大病害。在適宜的條件下， 病情發(fā)展很快， 幾天時間便會蔓延到全田， 造成葉片發(fā)黃、枯死， 產(chǎn)量損失巨大， 輕者減產(chǎn)10%~20%， 重者在30%以上， 給黃瓜生產(chǎn)帶來巨大威脅[4]。

霜霉菌P. cubensis 除了侵染黃瓜外， 還侵染葫蘆科的大約20 個屬40 個種的作物， 其中10 個種在黃瓜屬[5]。霜霉菌P. cubensis 侵染黃瓜屬的現(xiàn)象除了在美國、中國發(fā)生外， 已在世界70 個國家有過報道[6]。因此， 對黃瓜屬危害如此嚴重的病害， 引起了國內(nèi)外研究者的高度重視， 最近幾年， 從病理學(xué)方面的研究到與抗病育種相關(guān)的分子標記以及利用野生種進行抗性材料創(chuàng)新等方面的研究成果不斷涌現(xiàn)。雖然在此之前， 有人就黃瓜霜霉病侵染規(guī)律、抗性研究和綜合防治技術(shù)等方面進行了綜述[7]， 但是其內(nèi)容與當(dāng)前黃瓜霜霉病研究發(fā)展現(xiàn)狀相比已顯老化。

因此， 筆者根據(jù)黃瓜霜霉病研究的最新動態(tài)， 結(jié)合本實驗室的最新研究進展， 就霜霉菌的小種分化、接種與分級方法、抗性與葉片生理生化物質(zhì)含量的關(guān)系、霜霉病的抗性分子標記、抗病新材料的創(chuàng)制和抗病相關(guān)基因的分離等幾個方面進行全面綜述， 對以前的報道進行補充， 并對以后的研究方向進行展望， 以期為抗霜霉病黃瓜育種和研究工作提供參考。

1 黃瓜霜霉病菌的小種分化

在國際上， 有關(guān)P. cubensis 小種分化最早是Palti [5]在1974 年發(fā)現(xiàn)的， 他的研究結(jié)果表明黃瓜品種對P. cubensis 侵染后的不同反應(yīng)很可能是由于來源于不同國家病菌生理小種分化所致。Thomas[1]根據(jù)與轉(zhuǎn)化寄主親和力的程度不同， 認為P. cubensis 有5 種致病型。Lebeda[8]報道了美國的抗性品種不抗歐洲的P. cubensis 的分離物。Horejsi[9]報道在北美和歐洲沒有觀察到P. cubensis 的小種分化現(xiàn)象。Shetty[10]研究發(fā)現(xiàn)P. cubensis 存在著亞洲、波蘭和美洲小種分化， 并根據(jù)植物內(nèi)抗性基因?qū)?shù)推測有1～8 個生理小種。

在中國，“七五”期間， 天津市黃瓜研究所、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所聯(lián)合試驗， 利用統(tǒng)一鑒別寄主分析了其4 省市的霜霉病菌分化情況， 結(jié)果表明， 在致病力上有些菌株間雖有點差異， 但不存在小種分化的現(xiàn)象。傅俊范等[11]根據(jù)地區(qū)生態(tài)特點， 從黃瓜主要種植區(qū)采集病株， 從致病性和形態(tài)特征上進行分析， 結(jié)果表明， 我國黃瓜霜霉病菌也不存在生理小種分化?？傊?， 在國際上對P. cubensis 病菌是否存在小種分化還是有爭議的; 在國內(nèi)， 現(xiàn)有研究表明P. cubensis病菌不存在小種分化， 這可為國內(nèi)異地取樣接種提供便利。

2 黃瓜霜霉病抗性鑒定方法

2.1 田間抗霜霉病鑒定方法

2.1.1 非人工接種田間鑒定試驗地在定植前， 每hm2 施氮、磷、鉀肥分別為90、39、74 kg， 在甩蔓期( 4～6 片真葉) 每hm2 另加34 kg 氮肥。行株距1.5 m×0.3 m。直播于pH值6.4 的肥沃沙土地。每周灌水25～40 mm， 每hm2 加1 桶混有2.2 kg 抑草生和4.4 kg 地散磷藥劑。田間試驗材料感病過程是一個自然傳播過程。每4 行種1 行感病品種增強感染。植株通常到甩蔓期就表現(xiàn)出顯著的霜霉病癥狀。在感病后2～4 周進行病級統(tǒng)計。

2.1.2 田間人工接種鑒定方法把待鑒定的黃瓜材料催芽和播種， 并于出苗后2 周按行株距( 70 cm×30 cm) 統(tǒng)一定植于大田。為了增強感染力度和去除邊際效應(yīng)， 每隔3 行種植1 行感病品種。定植4 周后， 用孢子濃度2.5 ×104 個/mL 的菌液在田間噴霧接種。接種2 周后進行田間病級統(tǒng)計。

2.2 室內(nèi)霜霉病接種鑒定

2.2.1 離體霜霉病接種鑒定選用無病、健康和中等大小的葉片， 置于底部墊有潮濕紗布的培養(yǎng)皿中。滴上1 滴接種液( 0.01～0.03 mL， 孢子濃度為1.2×105 個/ mL) ， 進行點滴接種。蓋上培養(yǎng)皿， 置于溫度20 ℃ 左右的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周后進行病級統(tǒng)計。

2.2.2 活體子葉點滴接種法種子播于木箱內(nèi)， 木箱( 52 cm×36 cm×7 cm) 盛滿滅菌的蛭石。每個箱子都包含有陽性( 感病材料) 和陰性( 抗病材料) 對照。這些箱子被放置于加熱的萌發(fā)床萌發(fā)3～4 d。每棵完全展開的子葉用1 滴12×104 個/ mL 小孢子的菌液( 0.01～0.03 mL) 。每株接種后的第2片子葉用1 個巴氏管刺一刺作為標記。箱子置于塑料盒中，在溫度20 ℃、濕度100% 的條件下黑暗培養(yǎng)2 d。然后箱子被放置于1 個16 h 的光周期的溫室( 24～30 ℃) 培養(yǎng)， 并且在接種7～8 d 后記錄病癥。

2.2.3 2 片真葉期噴霧接種法在培養(yǎng)箱中進行， 接種小孢子濃度為5×103 個/ mL。接種植株在20 ℃ 和相對濕度100%條件下處理48 h。然后植株放置于溫度24～28 ℃ 的溫室中培養(yǎng)5 d， 7～8 d 后統(tǒng)計病級。

3 黃瓜霜霉病抗性相關(guān)生理生化基礎(chǔ)研究

劉慶元等[12]對13 個抗病性不同的黃瓜品種抗、感霜霉病葉片內(nèi)生理生化物質(zhì)的測定結(jié)果表明， 黃瓜不同品種葉內(nèi)含糖不同， 表現(xiàn)為含糖量愈高則發(fā)病愈輕， 并認為黃瓜霜霉病是一種低糖病害。云興福[13]對抗感品種的葉內(nèi)葉綠素含量的測定結(jié)果表明， 葉內(nèi)葉綠素含量的高低與植株抗病性強弱呈正比， 抗病品種葉色濃綠， 而感病品種葉色黃綠。丁九敏等[14]的研究表明， 在接種侵染前， 黃瓜健康葉片中的可溶性糖含量和葉綠素含量與自交系對霜霉病的抗性成正相關(guān); 接種后， 葉片中的POD、PPO、CAT 和SOD 的活性變化與自交系對霜霉病的抗性成正相關(guān)。

李靖等[15]對感染霜霉病的黃瓜葉片進行酶活性測定， 結(jié)果表明黃瓜抗病組合葉片多酚氧化酶PPO 活性的增加高于中抗和感病組合， 而中抗組合又高于感病組合， 抗性和中抗組合的過氧化物酶POD 活性的增加高于感病組合， 抗性組合苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶PAL 活性的增加高于中抗和感病組合。云興福等[16]對抗、感霜霉病兩類黃瓜品種的萌動種子、子葉、不同葉位真葉及定位葉片感染霜霉病菌后葉內(nèi)超氧化歧化酶SOD、多酚氧化酶PPO 和過氧化物酶POD 活性的測定結(jié)果表明， 接種后POD 活性增加， PPO 活性降低， SOD 活性先降后升， 但POD 和PPO 活性始終是抗病品種高于感病品種，與抗病性呈正相關(guān)， SOD 活性始終是感病品種高于抗病品種。潘汝謙等[17]認為黃瓜感染霜霉病后， 抗、感品種的SOD、CAT 和POD 活性都顯著地上升， 在接種后期感病品種CAT和POD 活性上升幅度大于抗病品種。

4 黃瓜霜霉病抗性遺傳規(guī)律及分子標記輔助育種研究

目前國內(nèi)外對黃瓜霜霉病抗性機制的研究存在2 種不同的研究結(jié)果， 即多基因抗性和單基因抗性[18]。Cochran[19]用耐病的印度黃瓜品種Bangalare 和感病品種雜交， 證明抗性由數(shù)個基因決定。Jenkins[20]用2 個不同的抗病材料Chineselong、Puerto Rico 分別和感病品種雜交， F1 代抗性中等， 以后的世代分析證實抗性是由1 個或2 個主基因和1 個或多個微效多基因共同作用的結(jié)果。呂淑珍等[21]研究認為， 霜霉病抗性至少由3 對基因控制， 感病性具有部分顯性。其廣義遺傳力為62.33%， 狹義遺傳力為47.74%， 屬于遺傳力較高的性狀， 容易穩(wěn)定。1992 年， Doruchoowski 等[22]利用抗性材料WI4783 和感病材料Wisconsin SMR 18 證明抗性是3 個隱性基因dm- 1、dm- 2、dm- 3 決定的。而另外一部分學(xué)者， 如VanVliet[23， 24]、Fanourakis[25]、Pierce[26]和Horejsi[9]則發(fā)現(xiàn)抗霜霉病基因是由1 個單隱性基因dm( 同P) 控制。

根據(jù)單隱性基因控制理論， Horejsi 等[9]通過對960 個RAPD 引物篩選， 在2 個抗感群體WI 1983G ×Straight 8、ZudmL ×Straight 8 中找到了5 個與dm 基因連鎖的RAPD 標記，分別是G14800、X151100、AS5800、BC5191100、EC5261000。在群體WI1983G ×Straight 8 中， 標記G14800、AS5800、BC5191100、EC5261000與dm 的遺傳距離分別為16.5、32.8、9.9、19.2 cm; 在群體ZudmL ×Straight 8 中， 標記G14800、X151100、AS5800、BC5191100 與dm的遺傳距離分別為20.9、14.8、24.8、32.9 cm?？傊?5 個標記中BC5191100 和G14800 與dm 連鎖較為緊密， 可望用于分子標記輔助育種。

5 抗霜霉病種質(zhì)創(chuàng)新和抗病相關(guān)基因分離

由于黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄， 種內(nèi)抗霜霉病資源有限， 通過遠緣雜交轉(zhuǎn)移近緣野生種中的抗性基因以拓寬黃瓜遺傳基礎(chǔ)、選育抗病新品種是一條解決黃瓜抗性問題的有效途徑。Chen JF 等[27]在西雙版納首次發(fā)現(xiàn)了黃瓜近緣野生種酸黃瓜( Cucumis hystrix) ， 抗病鑒定結(jié)果表明此物種高抗蔓枯病、霜霉病和病毒病等[28]， 本實驗室通過普通栽培黃瓜( Cucumissativus) 和酸黃瓜雜交， 首次合成了人工異源雙二倍體新種[29]， 并以其為橋梁種與普通黃瓜回交、自交， 先后選育出了黃瓜異源三倍體[30]、黃瓜單體異附加系[31]和抗霜霉病異源易位系CT- 01[32]。筆者對此異源易位系進行了形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)和RAPD 分子標記鑒定。此外， 還對其進行了多代自交， 并研究了其遺傳穩(wěn)定性。

最近， 本實驗室以高代抗霜霉病異源易位系CT01R 和感病突變系CT01S 為抗感對照材料， 設(shè)計2 對特異引物進行RT- PCR 擴增， 僅在抗病材料中獲得了與抗霜霉病相關(guān)的基因序列cpc- 1[33]。通過半定量RT- PCR 表達分析， 此基因序列在根、莖和葉中都表達， 表達量的大小順序: 葉>莖>根。利用此抗霜霉病異源易位系為親本， 選育了抗霜霉病黃瓜加工專用型新品種寧佳3 號[33]。

6 問題及展望

6.1 霜霉菌的接種濃度問題

在P. cubensis 接種濃度方面國內(nèi)研究與國外的差異較大， 區(qū)別主要在于國內(nèi)研究者用的是孢子囊的濃度， 而國外研究者則主要用小孢子濃度。原因是P. cubensis 侵染寄主時， 除了孢子囊直接萌發(fā)侵染外， 孢子囊在4 ℃下游離出大量的小孢子， 小孢子對寄主侵染力較強并是感染寄主的主要形式， 而且如果人工低溫處理可使孢子囊濃度在游離出小孢子后濃度劇增( 待發(fā)表) 。因此， 接種時以小孢子濃度計算更為科學(xué)。

6.2 接種方法問題

在接種方法方面， 一般有子葉期、真葉期的室內(nèi)接種法， 也有田間非人工田間自然發(fā)病和田間人工接種法。室內(nèi)接種簡單， 工作量小， 但要求較高的人工條件; 田間非人工和人工接種較接近實際， 但工作量大， 受環(huán)境影響大。因此， 二者結(jié)合將會更加科學(xué)。

6.3 抗性遺傳規(guī)律問題

有關(guān)黃瓜霜霉病抗性遺傳規(guī)律的研究雖然不少， 但由于所用抗性材料不同， 對應(yīng)材料的抗性水平也有差異， 接種鑒定的方法可能也不同， 因而抗性規(guī)律的結(jié)果就出現(xiàn)了分歧。因此， 黃瓜抗霜霉病的遺傳規(guī)律仍不明確， 仍需要進一步研究加以明確?？顾共』虻姆肿訕擞涬m然篩選到了幾個RAPD 標記， 但是由于遺傳規(guī)律還沒有定論， RAPD 標記不穩(wěn)定， 遺傳距離并不緊密， 因此這方面的研究仍需大量的工作。

6.4 展望

國內(nèi)不存在黃瓜霜霉病菌的小種分化， 國際上可能存在著亞洲、歐洲和美洲小種分化現(xiàn)象， 但這并沒有得到最終明確， 仍需要國內(nèi)外病理學(xué)家繼續(xù)深入研究加以解決。在世界黃瓜品種選育競爭中， 我國育種家面臨的挑戰(zhàn)是不僅要培育出中國或亞洲的抗霜霉病黃瓜新品種， 而且還要培育出在國際上抗霜霉病的黃瓜新品種。在基因知識產(chǎn)權(quán)競爭中， 黃瓜抗霜霉病基因至今在國際上沒有得到克隆和申請專利， 雖然筆者分離了抗性相關(guān)基因片段， 但此抗病相關(guān)基因序列的全長還沒拿到以及基因的功能還沒有得到最終驗證。因而， 這方面的工作仍需扎實、深入地研究下去。

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