中圖分類號(hào)：S572.02 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-5119（2025）03-0012-08

Pollen Morphology of 40 Germplasm Resources of Nicotiana and Its Taxonomic Significance

GUO Kaiyang1， WANG Rengang2*， WANG Zili2，LIN Shifeng2， YANG Zhixiao2， ZHANG Jie2，LIU Guoqin1* （1.Collge ofobaccoScience，GuzhouUniversityGuiang55025，China;2.GuizouAcademyofTobacoScience/Molecular GeneticsKeyLaboratory ofChina Tobacco， Guiyang55oo81， China）

Abstract： Toexplorethe palynologicalcharacteristicsof Ncotiana andits taxonomic significane，we examiedpollnmorphology of36wild species and4cultivated varieties using scaning electron microscopyand investigated their taxonomicrelationships throughclusteraalysis.Teresultsevealedthatall4accessionsexibited monad，isopolarplengrainswithtricolpateor tetracolporate apertures， displaying spherical to prolate shapes [P/E^{=1.66（0.99-2.16）}] and measuring 39.96 （26.55-58.08） μm×24.28 （17.83–33.79） μm Seven exine ormamentation types were identified， including verrucate， verrucate-rugulate，rugulate， rugulatestriate，strate，triateeticulate，ndeticlate，amongichtestratetype asthemostprevaent，andmostspecisebitedeine perforations.PolensizeandexineomamentationwereidentifiedasthekeydiagnosticcharacteristicsforNicotianapollen diferentiation.Clusteranalysisbasedoncharacteristic values clasifiedthe40taxaintothreegroupsatasimilaritycoeffcientof 15.73.Thecusteringresultsofixsctions （icotianst.Nicotiaa，icotiansct.Paniculatae，NicotianasctPetides， Nicotian sect.Repandae，Nicotianasect.Tomentosae，andNicotianasect.Trigonophylae）wereconsistent withtheKnapp taxonomicsystem.Thepalyologicalresultsprovidesignificantcoroborativeevidenceforthe taxonomic studyofNicotian，with the classification results generally supporting findings from molecular systematic research.

eywords： Nicotiana; wild species; pollen morphology; electron microscopy scanning; taxonom

煙屬（Nicotiana）是茄科（Solanaceae）第五大屬，屬內(nèi)成員眾多，目前公認(rèn)的有82個(gè)種[1]。在煙屬植物中，普通煙草（NicotianatabacumL.）和黃花煙草（NicotianarusticaL.）兩個(gè)種被大規(guī)模栽培利用，培育出了眾多的栽培品種[2]。具翼煙草（NicotianaalataLinkamp;Otto）和藍(lán)格斯多夫煙草（NicotianalangsdorffiiWeinm.）因其艷麗的花色和獨(dú)特的氣味特征，被作為觀賞植物種植[3]。本塞姆氏煙草（NicotianabenthamianaDomin）具備良好的瞬時(shí)蛋白表達(dá)特征，易于病毒誘導(dǎo)的基因沉默，是研究植物與微生物相互作用的模式植物[4]。其余種多用于栽培品種的遺傳改良研究，是品種選育及品質(zhì)改良的重要基因資源[5]。物種間明確的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系能為栽培品種的遺傳改良提供選擇背景，但目前學(xué)術(shù)界對(duì)于煙屬的分類問(wèn)題存在著較大的爭(zhēng)議[]。1954年植物學(xué)家Goodspeed結(jié)合煙屬植物的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等內(nèi)容，在《煙屬》一書中將當(dāng)時(shí)的66個(gè)種劃分為3個(gè)亞屬和14個(gè)組，提出的分類系統(tǒng)影響了學(xué)術(shù)界半個(gè)多世紀(jì)[7]。隨著熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、基因組測(cè)序等現(xiàn)代分子生物技術(shù)的深入應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)部分物種的親緣關(guān)系與Good-speed的描述存在差異[8]。2004年Knapp 等[9]結(jié)合最新的研究成果對(duì)Goodspeed的分類系統(tǒng)進(jìn)行修訂，將現(xiàn)有的82個(gè)種分為13個(gè)組，亞屬的概念被淡化。目前不同學(xué)者對(duì)煙屬的分類問(wèn)題有不同的看法，以植物形態(tài)特征為依據(jù)的分類研究更傾向于支持Goodspeed分類系統(tǒng)[10]，而以核基因及質(zhì)體基因?yàn)橐罁?jù)的分類研究則更傾向于支持Knapp分類系統(tǒng)[11-12]。目前煙屬的進(jìn)化關(guān)系仍存在許多不明確的問(wèn)題，煙屬的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系還需更多的依據(jù)作為支撐。

花粉是植物攜帶遺傳信息的雄性生殖器，其形態(tài)結(jié)構(gòu)具有嚴(yán)格的遺傳保守性?；ǚ燮鹪从谥参锬阁w，成熟后才脫離母體，在生長(zhǎng)過(guò)程中受環(huán)境因素影響很小[13]?；ǚ弁獗谥饕煽垢g性極強(qiáng)的孢粉素組成，能在地層中千百萬(wàn)年不腐[14]。古生物孢粉化石研究表明，近百萬(wàn)年來(lái)花粉在形狀特征上的變異程度很低[15]，因而近緣物種花粉的結(jié)構(gòu)具有較高的相似度?，F(xiàn)階段孢粉學(xué)在系統(tǒng)學(xué)領(lǐng)域有著重要的作用，依據(jù)花粉的形態(tài)特征，能夠?qū)⒋蟛糠直蛔又参锒ㄎ坏健翱芢"這一分類單元[16]。

近年來(lái)，花粉形態(tài)在更小分類單元的研究逐漸增多，朱琳等[17]比較了野生扁蓿豆（Medicagoruthenica（L.）Sojak）及其近緣種的外壁紋飾差異，為其屬間劃分提供依據(jù)；Fan等[18]基于蠟梅（ChimonanthuspraecoxL.）栽培品種的花粉形態(tài)聚類分析，發(fā)現(xiàn)其分組結(jié)果與傳統(tǒng)花色分類體系高度一致；趙藝璇等[19]通過(guò)分析木槿（HibiscussyriacusL.）不同地理種群的花粉外壁紋飾形態(tài)變異，揭示了其種內(nèi)遺傳分化的親緣關(guān)系。這些研究表明，花粉形態(tài)在屬、種間也具有分類價(jià)值。陳曦等[20]、何川生等[21]曾先后報(bào)道過(guò)普通煙草和黃花煙草的栽培品種的花粉形態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于煙屬野生種的孢粉學(xué)研究較少。為此，本研究觀察了煙屬36份野生種及4份栽培品種的花粉形態(tài)，同時(shí)采用聚類分析的方法探究煙屬花粉形態(tài)的分類學(xué)關(guān)系，以期豐富煙屬的孢粉學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究涉及煙屬的36個(gè)野生種、普通煙草的3個(gè)栽培品種和黃花煙草的1個(gè)栽培品種（表1），所有用于電鏡觀察的植物樣本均取自貴州省煙草科學(xué)研究院。

1.2 方法

選擇無(wú)病健壯的植株，于盛花期采摘含苞待放的花朵，用干凈鑷子將花朵剝開(kāi)，剪去柱頭，將花藥剪下直接置于離心管中，加 1mL 冰醋酸，用玻璃棒將花藥研磨破碎，然后加入 10mL 蒸餾水，于離心機(jī) 3000r/min 離心 10min ，去除上清液，加入醋酸酐-濃硫酸 （9：1） 混合液 1.5～2.0mL ，沸水浴 5min ，取出冷卻后加入 10mL 蒸餾水，3000r/min 離心 10min ，去除上清液后，可得到大量花粉。將花粉滴加甘油膠制片，自然干燥，用導(dǎo)電膠將片子粘在樣品臺(tái)上，用日立E1010離子濺射儀鍍金，日立S3400N型掃描電子顯微鏡拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用ImageJ處理花粉圖片，每個(gè)樣品挑選典型花粉20個(gè)，參照阮淑明[22]的方法，測(cè)量花粉的極軸長(zhǎng) （P） 、赤道長(zhǎng) （E） ，并計(jì)算極軸長(zhǎng)與赤道長(zhǎng)的比值 P/E ，同時(shí)測(cè)量花粉外壁穿孔密度、穿孔直徑，用Exce116計(jì)算各組數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差?；ǚ鄣男螤?、極面觀、赤道面、外壁紋飾、萌發(fā)孔類型根據(jù)Buchner等[23]和楊明樂(lè)等[24的專業(yè)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行描述，使用R4.3.3語(yǔ)言的“ape\"包進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果

2.1 花粉的形態(tài)特征

2.1.1 形狀與大小 如圖1、表2所示，本研究的煙屬花粉均為單胞花粉，等極，中等尺寸，花粉大小為 39.96（26.55～58.08）μm×24.28（17.83～33.79）μm P/E=1.66（0.99～2.16） ，其中 N. eastill的花粉粒最大，為 58.08μm×29.21μm ： N. tabacum cv.Maeryan 的花粉粒最小，為 30.54μm×17.83μm 。根據(jù)《孢粉學(xué)概論》[25]的方法，令 0.88?P/Elt;1.14 為近球形，1.14?P/Elt;2.00 為長(zhǎng)球形， P/E≈2.00 為超長(zhǎng)球型，則有5個(gè)種的形狀為近球形，分別為 N. acuminata、N. pauciflora、N. nesophila、N. stocktonii、N.afri-cana；4個(gè)種的形狀為超長(zhǎng)球形，分別為N.occiden-talis、N. suaveolens、N. palmeri、N. trigonophylla;其余31個(gè)種均為長(zhǎng)球形。除N.tabacumcv.Maer-yan花粉的極面觀同時(shí)存在三裂圓形和四裂圓形兩種類型外，其余種的極面觀均為三裂圓形。同樣的，N.tabacumcv.Maeryan的萌發(fā)孔具備三孔溝和四孔溝兩種類型，其余材料的均為三孔溝。赤道面主要為窄橢圓形，N.acuminata、N.pauciflora、N.nesophila、N.stocktonii4個(gè)種的赤道面為近圓形，而N.tabacumcv.Maeryan的赤道面為長(zhǎng)方形。2.1.2外壁紋飾40份供試材料花粉的外壁紋飾

注：la-1b，馬耳煙赤道面（長(zhǎng)方形）和外壁紋飾（疣狀）；2a-2b，香煙草赤道面（窄橢圓形）和外壁紋飾（疣狀-褶皺狀）；3a-3b，斯托克通氏煙草赤道 面（近圓形）和外壁紋飾（褶皺狀）； 4a～4b ，島生煙草赤道面（近圓形）和外壁紋飾（褶皺狀）； 5a～5b ，非洲煙草赤道面（窄橢圓形）和外壁紋飾（褶皺狀- 條紋狀）；6a-6b，具翼煙草赤道面（窄橢圓形）和外壁紋飾（條紋狀）；7a＼～7b，Orinoco赤道面（窄橢圓形）和外壁紋飾（條紋狀-網(wǎng)狀）；8a＼～8b，耳狀煙 草赤道面（窄橢圓形）和外壁紋飾（網(wǎng)狀）。

ote eib viewub lt （striate-reticulate）;8a-8b，N.otophora，quatorialonamentation （narrowlyeliptic），exinesculpturing （reticulate）.

圖1供試材料花粉形態(tài)

有疣狀、褶皺狀、條紋狀、網(wǎng)狀4種基本紋飾，以及疣狀-褶皺狀、褶皺狀-條紋狀、條紋狀-網(wǎng)狀3種復(fù)合紋飾。其中條紋狀紋飾為最主要的類型，有30份資源的花粉具有條紋狀紋飾。此外，穿孔也是花粉外壁紋飾的主要特征，有30份資源花粉的外壁上具有穿孔。

在13個(gè)組中，除普通煙草組、圓錐煙草組及香甜煙草組3組成員間的外壁紋飾差異較大外，其余分組的組內(nèi)成員花粉的外壁紋飾差異較小。具翼煙草組的外壁紋飾主要為條紋狀，除N.plumbagini-folia外均具穿孔；漸尖葉煙草組均為條紋狀紋飾且不具穿孔；殘波煙草組均為褶皺狀紋飾且具穿孔;絨毛煙草組均為網(wǎng)狀紋飾且具穿孔；三角葉煙草組均為褶皺狀-條紋狀紋飾且具穿孔；波葉煙草組均為褶皺狀-條紋狀紋飾，除N.undulata外均具有穿孔。普通煙草組的外壁具有穿孔，但外壁紋飾的類型不相同；圓錐煙草組則是 N. paniculata的外壁紋飾與另外兩個(gè)種不同。

2.240份資源花粉形態(tài)的聚類分析

在煙屬花粉的各項(xiàng)指標(biāo)中，極軸長(zhǎng) （P） 、赤道長(zhǎng) （E） 及其比值 P/E ，花粉外壁紋飾種類及穿孔的密度和直徑是區(qū)分各個(gè)種的主要特征值，為進(jìn)一步研究煙屬植物花粉形態(tài)與各個(gè)種之間的關(guān)系，參照Song等[1]的方法，采用賦值法對(duì)外壁紋飾的類型賦值，令疣狀 ：=1 、疣狀-褶皺狀 ：=1.5 、褶皺狀 ₌₂ 、褶皺狀-條紋狀 ：=2.5 、條紋狀 ⁼³ 、條紋狀-網(wǎng)狀 ：=3.5 、網(wǎng)狀 ：=4 。選取P/E、 P 1 E 、外壁紋飾、穿孔密度、穿孔直徑這6組特征值，采用歐式距離最大距離法對(duì)煙屬花粉的形態(tài)特征進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。

在相似系數(shù)為15.73時(shí)，40個(gè)種被聚為3個(gè)類群，第一類群共18個(gè)種，分別來(lái)自具翼煙草組、殘波煙草組、波葉煙草組、三角葉煙草組以及香甜煙草組；第二類群共15個(gè)種，分別歸屬于普通煙草組、林煙草組、黃花煙草組、圓錐煙草組、絨毛煙草組、夜花煙草組、漸尖葉煙草組、多室煙草組及香甜煙草組；第三類群則是香甜煙草組的7個(gè)種。普通煙草組、圓錐煙草組、漸尖葉煙草組、殘波煙草組、三角葉煙草組和絨毛煙草組6個(gè)組聚類結(jié)果與煙屬的分類結(jié)果一致，而具翼煙草組、波葉煙草組及香甜煙草組的聚類結(jié)果與煙屬的分類結(jié)果有較大差異。

3討論

3.1煙屬植物的孢粉學(xué)特性

被子植物花粉的萌發(fā)孔、外壁紋飾等特征是相對(duì)穩(wěn)定的，其分類價(jià)值已得到普遍的認(rèn)可[25]。由于花粉的形狀和尺寸容易受到溫度、濕度等環(huán)境條件以及制備方法的影響，因此也有部分學(xué)者認(rèn)為花粉的形狀和大小不能作為分類的指標(biāo)[27-28]。有研究顯示，根據(jù)花粉的大小和外壁刺長(zhǎng)能有效對(duì)錦葵科（Malvaceae）物種進(jìn)行分類[29]。Wang等[30]根據(jù)花粉尺寸、外壁紋飾類型研究八角屬（IlliciaceaeL.）和五味子屬（SchisandraMichx.）的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系，其結(jié)果與分子系統(tǒng)的研究結(jié)果基本一致。本研究以花粉的尺寸、外壁紋飾類型進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果與Knapp等[2的分類結(jié)果基本吻合。因此本研究認(rèn)為煙屬植物的花粉形態(tài)是具備分類學(xué)意義的。

前人的研究中，茄科植物花粉的形狀多為橢球形，赤道面以圓形和窄橢圓形為主，極面觀主要為三裂圓形，萌發(fā)孔形狀主要為三孔溝，最長(zhǎng)軸為19.95～50.47μm ，外壁紋飾有褶皺狀、網(wǎng)狀等11種類型[16，31-32]。本研究所選煙屬植物的花粉形態(tài)符合茄科植物的花粉特征，其中 N. tabacum、N.acuminata、N.glutinosa等物種的外壁紋飾與前人的研究結(jié)果一致，但花粉的形狀和尺寸存在些許差異[16，20-21]，這可能是取樣環(huán)境的不同或者花粉制備方法的差異導(dǎo)致的。

根據(jù)被子植物花粉形態(tài)的演化規(guī)律，花粉的形狀由舟形向球形再向長(zhǎng)球形或扁球形演化，極性由單極向等極再向多極演化或異極演化，萌發(fā)孔由無(wú)孔向多孔演化[14-15，25]。本研究的花粉多為長(zhǎng)球形、等極、三孔溝，屬于進(jìn)化程度較高的花粉。其中N.pauciflora、N.acuminata、N.africana等的形狀接近于球形，屬于較為原始的花粉。而N.tabacumcv.Maeryan的萌發(fā)孔存在三孔溝、四孔溝兩種類型，為萌發(fā)孔進(jìn)化較快的類型。

3.2煙屬部分物種的親緣關(guān)系

煙屬形成于0.75＼～1億年前，其中N.tabacum和N.rustica是最年輕的自然形成的四倍體，約于20萬(wàn)年前形成[26.33]。N.tabacum 的起源過(guò)程仍有爭(zhēng)議，目前有充足的證據(jù)證明其母系祖先是 N. sylvestris[11-12]，而父系祖先可能是 N. tomentosifor-mis，也可能是 N. tomentosiformis和N.otophora的雜交漸滲系[34-36]。本研究的結(jié)果顯示普通煙草組的3個(gè)栽培種的花粉形態(tài)與 N. sylvestris的相似度最高，說(shuō)明N.tabacum與N.sylvestris有較近的親緣關(guān)系；普通煙草組與絨毛煙草組2個(gè)成員的花粉也較為相似，但缺少N.tomentosiformis的樣本，因此還需要擴(kuò)增樣本進(jìn)一步研究。

關(guān)于N.rustica起源過(guò)程的研究結(jié)果較為一致，認(rèn)為其由N.undulata（父系祖先）和N.paniculata（母系祖先）雜交后自然加倍形成[37-39]。本研究的聚類結(jié)果顯示，N.rustica和N.paniculata的距離最近，但與N.undulata的距離較遠(yuǎn)，由于花粉的形態(tài)由多基因控制[40]，因此本研究?jī)H能確定N.rustica與N.paniculata的親緣關(guān)系較近，難以確定N.undulata對(duì) N. rustica花粉遺傳組成的貢獻(xiàn)。

多室煙草組包含N.quadrivalvis和N.clevelandii兩個(gè)種，約于100萬(wàn)年前形成，早期核基因組的研究認(rèn)為，多室煙草組的母系祖先可能是三角葉煙草組的N.obtusifolia，父系祖先是漸尖葉煙草的 N. attenuate[26-28]；近年來(lái)，葉綠體基因組的研究結(jié)果顯示，多室煙草組的母系祖先是N.attenuate，而父系祖先是波葉煙草組的N.undulata[11-12]。本研究的結(jié)果顯示，N.quadrivalvis與漸尖葉煙草組的親緣關(guān)系較近，但不能確定其母系親本和父系親本。

N.glutinosa被Goodspood放在絨毛煙草組中，但又指出N.glutinosa的表型混有其他組的特征，后來(lái)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、基因組原位雜交（GISH）的研究結(jié)果顯示，N.glutinosa與波葉煙草組的N.arentsii和N.undulata、三角葉煙草組的 N. thyrsifiora是姐妹種[8，27]，因此Knapp 在修訂煙屬分類系統(tǒng)時(shí)將其調(diào)整到波葉煙草組中[26.33]。本研究顯示，N.glutinosa的花粉形態(tài)與具翼煙草組的N.longiflora和香甜煙草組的N.velutina的相似度最高，但具翼煙草組和香甜煙草組的聚類效果并不好，此外其與波葉煙草組和三角葉煙草組的相似度較高，意味著N.glutinosa可能與波葉煙草組和三角葉煙草組的親緣關(guān)系更近，本研究支持把N.glutinosa歸類至波葉煙草組中。

真翼煙草組和香甜煙草組是煙屬中染色體變異最大的兩個(gè)組，其中具翼煙草屬于異倍體（ n=9，10 ，香甜煙草組為非整倍體（ n=16～23 ），這些物種的形成過(guò)程仍有許多疑問(wèn)。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為染色體數(shù)目的變化可能是種間雜交及染色體的異源多倍化的結(jié)果[41]。從地理分布來(lái)看，具翼煙草組分布在墨西哥高原的荒漠上，香甜煙草組中的 N. africana源于非洲的納米比亞平原，N.fragrans等幾個(gè)種分布在南太平洋美拉尼亞的島嶼上，其余大部分物種分布于澳大利亞西南部的沙漠地帶，這些區(qū)域多為高溫、低溫、干旱等逆境環(huán)境。因此，環(huán)境脅迫可能作為一種強(qiáng)大的選擇壓力，篩選并維持了這些適應(yīng)逆境的染色體變異類型[9.42]。本研究中花粉的聚類結(jié)果顯示，具翼煙草組被分散在同一簇中，而香甜煙草組被分在了3個(gè)距離較遠(yuǎn)的分枝上，可能是這些物種形成之初基因的重新組合使花粉的形態(tài)發(fā)生了改變，也可能是物種在進(jìn)化過(guò)程中染色體變異以及環(huán)境差異等因素導(dǎo)致花粉產(chǎn)生了變異。

4結(jié)論

本研究觀察的40份煙屬種質(zhì)的花粉為單胞花粉，等極，三孔溝或四孔溝，球形至超長(zhǎng)球形，P/E=1.66（0.99～2.16） ，尺寸 39.96（26.55-58.08）μm× 24.28（17.83-33.79）μm ，外壁紋飾有條紋狀、網(wǎng)狀等7種類型，其中含有條紋狀紋飾的種最多，大部分物種的花粉外壁上具有穿孔，花粉的外壁紋飾和花粉大小是鑒別不同種質(zhì)花粉的主要特征。以P/E、P 一 E 、外壁紋飾、穿孔密度、穿孔直徑等6組特征值對(duì)40份材料進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為15.73時(shí)，40個(gè)種被分為3個(gè)類群，普通煙草組、圓錐煙草組、漸尖葉煙草組、殘波煙草組、絨毛煙草組以及三角葉煙草組6個(gè)組的聚類結(jié)果與煙屬的分類結(jié)果一致。本研究豐富了煙屬的孢粉學(xué)內(nèi)容，為煙屬的分類研究提供了參考依據(jù)。

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