中圖分類號(hào)：S661.1：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025）06-0028-09

AbstractPotassium （K）is one of the essential mineral elements for plant growth and development， which is very important for yield and quality formation. HAK5 is an important high-affinity K transporter gene， which mainly mediates K uptake under low K conditions.However，litle is known about the functional role of HAK5 in Malus. In this study，Malus haliana was used as experimental material，and its HAK5 （MhHAK5） gene was cloned and analyzed.The physicochemical properties and tissue expression specificity were analyzed by bioinformatics analysis，and the response to low K was studied through overexpressing MhHAK5 in Arabidopsis thaliana by genetic transformation.The results showed that the full length of MhHAK5 gene was 1 830 bp with the open reading frame （ORF）as 1695bp ，and it encoded 518 amino acids. The MhHAK5 protein had the molecular weight of 60.05kDa and the isoelectric point of 7.45， had four transmembrane structures， was an unstable hydrophilic transmembrane protein，and was located in nucleus.Phylogenetic analysis showed that MhHAK5 had the highest similarity with AtHAK5，AtHAK1O in Arabidopsis thaliana and OsHAK5 in rice.Furthermore，it had Ser-Gly-Gly-Gly amino acid sequence.The results of tissue expresson specificity analysis showed that MhHAK5 had the highest expression level in roots of M. halliana，and was induced by low potassium. Compared with wild type （WT），overexpression of MhHAK5 could effctively improve K⁺ absorption and growth-promoting plant hormone synthesis of Arabidopsis plants under low K conditions，thus ensuring root development.In summary，MhHAK5 played an important role in response to K deficiency stress.The results ofthis study could provide theoretical bases for gene improvement and breeding of K deficiency tolerant apple rootstocks.

KeywordsMalus haliana ; MhHAK5 gene； Bioinformatics analysis; Potassium deficiency stress ； Geneexpression

鉀（K）是植物必需的礦質(zhì)養(yǎng)分之一，與氮、磷的利用方式不同，K在植物體中不會(huì)被同化為有機(jī)物，主要以鉀離子（ K⁺ ）形態(tài)存在并發(fā)揮作用[1]。 K⁺ 參與許多植物生理過程，例如調(diào)節(jié)滲透壓、維持細(xì)胞膨壓、促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成、調(diào)控膜極化以及同化產(chǎn)物的運(yùn)輸?shù)萚2]，影響著植物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成。全球鉀資源分布極不均勻，當(dāng)植物生長(zhǎng)在K有效含量較低的土壤中時(shí)，生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝都會(huì)受到消極影響[3]。我國(guó)土壤鉀主要以礦物態(tài)存在，造成土壤有效鉀含量偏低，再加上鉀肥資源短缺及植物鉀利用效率較低，使得植物體內(nèi)鉀含量不足，已成為目前導(dǎo)致其產(chǎn)品質(zhì)量欠佳的重要原因[4] 。

研究表明，植物具有復(fù)雜的信號(hào)通路以應(yīng)對(duì)根圍 K⁺ 濃度的變化，當(dāng)根圍 K⁺ 濃度低于 2mmolL 時(shí)，高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（HATs）被誘導(dǎo)通過 H⁺/K⁺ 質(zhì)子泵方式發(fā)揮主要作用，而當(dāng) K⁺ 濃度高于 2mmol/L 時(shí)，低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（LATs）則起主要作用[1，5-6]。高親和力鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HAK）是鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體KT/KUP/HAK超家族的重要組成部分，具有單價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)特性[]。HAK家族蛋白具有4＼～12個(gè)跨膜區(qū)域[8，通常在第2個(gè)與第3個(gè)跨膜區(qū)域之間存在著1個(gè)帶電荷的中央親水環(huán)[7]，第3個(gè)與第4個(gè)跨膜區(qū)域之間存在著首個(gè)PA環(huán)保守位點(diǎn)的氨基酸序列[9]。該家族蛋白不僅是 K⁺-Na⁺ 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是 ΔNa⁺，K⁺ 的單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]。研究表明，HAK成員具有增強(qiáng)植物抗旱、耐鹽堿及抗病性的作用[7，11]，尤其在缺鉀情況下可誘導(dǎo)植物根系促生長(zhǎng)激素的合成，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，并且調(diào)節(jié)植物對(duì) K⁺ 的吸收，目前已發(fā)現(xiàn) HAKI、HAK5、HAK7 基因參與低鉀脅迫下的鉀

離子吸收調(diào)節(jié)[8，12-13] 。

垂絲海棠（Malushalliana）是薔薇科蘋果屬（Malus）落葉喬木，根系健壯，韌皮部細(xì)胞代謝較快，常用作蘋果砧木[14]。目前我國(guó)對(duì)垂絲海棠的研究相對(duì)較少，且主要集中于探索其逆境耐受性，目前已知其具有優(yōu)異的耐貧瘠、耐鹽堿及耐干旱等性能[15]。由于蘋果栽培過程中的不合理施肥管理，果園土壤質(zhì)量退化日益嚴(yán)重，低鉀脅迫已成為制約蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[16]。采用基因改良方式改善植物對(duì)低鉀脅迫的耐性以及提高鉀利用效率，相比于傳統(tǒng)的增施鉀肥方法，具有省時(shí)、高效、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[17]?；诖?，本研究以垂絲海棠為試材，克隆低鉀脅迫下高親和力鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MhHAK5，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其在擬南芥中過表達(dá)，研究其在植株響應(yīng)低鉀脅迫中的功能，以期為耐低鉀蘋果砧木的基因改良與選育提供理論基礎(chǔ)

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗(yàn)處理

1.1.1植物材料試驗(yàn)于2022年5—9月在省市的理工學(xué)院植物人工氣候室中進(jìn)行。垂絲海棠幼苗來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所；供試野生型（WT）擬南芥（Arabidopsisthaliana）為哥倫比亞生態(tài)型，供試煙草（Nicotianatabacum）品種為紅花煙草，均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 菌株和載體大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)，購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)、pCAMBIA1300改造載體（Super1300超表達(dá)載體），皆購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司

1.1.3植物材料的培養(yǎng)及試驗(yàn)處理 將垂絲海棠幼苗栽種于裝有 3L Han's營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)桶中，置于人工氣候室中預(yù)培養(yǎng)7d，培養(yǎng)條件為光周期16h 光 ^′8h 暗、光照強(qiáng)度 5800lx 、晝/夜溫度26^°C/18^°C [18]。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后分別采用正常供鉀（ 2mmol/L ，CK）和低鉀（ 0.5mmol/L， LK）的全量改良Han's營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行不同濃度鉀處理培養(yǎng)，處理7d后采集根系樣品并迅速用液氮冷凍，于-80°C 保存。所用鉀源為 K₂SO₄ （分析純），每個(gè)處理3次重復(fù)。

紅花煙草培養(yǎng)的外部環(huán)境條件同垂絲海棠幼苗，固體培養(yǎng)基配方為 MS+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂（ pH 值6.5），每?jī)芍芾^代1次。

1.2 垂絲海棠MhHAK5基因的克隆及生物信息學(xué)分析

1.2.1MhHAK5基因的克隆稱取 200.00mg 冷凍的垂絲海棠根系樣品，按照Trizol總RNA提取試劑盒相關(guān)說(shuō)明提取總RNA，采用PrimeScriptRTMasterMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一條cD-NA。在蘋果屬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR（https：//www.rosaceae.org/）中檢索出MhHAK5的編碼區(qū)序列，用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以cD-NA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照張瑞等[18]的方法。將擴(kuò)增的片段與pCAMBIA1300克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2MhHAK5基因的生物信息學(xué)分析擬南芥AtHAK5、水稻OsHAK5、煙草NtHAK3、鹽角草Se-HAK5等蛋白的氨基酸序列從TAIR9.0（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//planttfdb.cbi.pku.edu. cn/ ）下載，使用DNAman軟件的ClustalW程序?qū)Λ@得的各物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并基于MEGA7.0軟件采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用SWISS - MODEL （http：//swissmodel. expasy. org/）分析MhHAK5蛋白的分子模型。采用ExPASy工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析推定的MhHAK5蛋白的序列長(zhǎng)度、分子量及等電點(diǎn)（pI）等[19] O

MhHAK5的亞細(xì)胞定位：將設(shè)計(jì)好的Mh-HAK5引物（表1）用于PCR擴(kuò)增基因，采用 β- 雌二醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，將MhHAK5編碼序列克隆到SUPERR：sXVE：GFP：Bar載體中;使用Bio-RadGenePulser通過電穿孔將含有GFP、Mh-HAK5-GFP和HAK5-mCherry的載體轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌（GV3101）細(xì)胞中，然后將農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)染至紅花煙草葉片中[20]，共培養(yǎng) 24h 后，采用100mmol/L β -雌二醇溶液注射葉片以誘導(dǎo)靶基因表達(dá)；將注射成功的紅花煙草在 25°C 、弱光條件下培養(yǎng) ^72h ，之后通過共聚焦激光掃描顯微鏡（ZEISS710，卡爾蔡司，德國(guó)）觀察GFP（綠色熒光蛋白）熒光。

1.3 MhHAK5過表達(dá)擬南芥的獲得

參照朱飛雪等[21]的方法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，得到 T₀ 代擬南芥種子；將 T₀ 代種子用 75% 酒精處理 3min?3% NaClO處理 10min ，流動(dòng)無(wú)菌水沖洗5次，然后播到含有 1/2Han 's營(yíng)養(yǎng)液的MS 培養(yǎng)基上，采用 50mg/L 潮霉素篩選，獲得 T₁ 代MhHAK5過表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥；經(jīng)過連續(xù)3代的篩選，最終獲得純合的 T₃ 代轉(zhuǎn)基因植株，用于后續(xù)基因功能研究

1.4MhHAK5在垂絲海棠不同組織中的表達(dá)分析

按照上述基因克隆方法中的提取方式從垂絲海棠根、莖、葉中提取RNA，并采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀（NanoDrop2000，北京芯起點(diǎn)基因科技有限公司）檢測(cè)RNA 濃度。采用TransStartTMGreenqPCRSuperMix試劑盒合成首條cDNA，并采用無(wú)菌水將cDNA稀釋100倍用作實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）的模板。采用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用LightCycler？96熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR分析。PCR擴(kuò)增體系及程序參照Z(yǔ)hang等[22]所述，基因表達(dá)量采用斷層掃描法（2 （2^-ΔΔCt ）計(jì)算。

1.5野生型和MhHAK5過表達(dá)擬南芥根系 K⁺ 通量、植株K含量及生長(zhǎng)激素測(cè)定

采用非侵入性微測(cè)試技術(shù)（NMT）和自動(dòng)掃描電極技術(shù)（ASET2.0，美國(guó)）測(cè)量?jī)?K⁺ 通量[23]。采用正常供鉀（2mmol/L）與低鉀（ 0.5mmol/L） 改良Han's營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng) 96h 后，用蒸餾水小心沖洗野生型擬南芥和MhHAK5過表達(dá)株系的根系，分別收集具有 3cm 的不定根（AR）和發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因根（TR）的細(xì)根。使用 K⁺ 的能斯特斜率大于 52mV 的離子微電極測(cè)定缺鉀處理的K⁺ 通量；對(duì)于正常供鉀處理，則先采用鉀溶液（0.1mmol/LKCl，0.1mmol/L MES 緩沖液）平衡10min ，再測(cè)定根系伸長(zhǎng)區(qū)和分生區(qū)的離子通量，每個(gè)根區(qū)的每個(gè)測(cè)量點(diǎn)連續(xù)記錄 6min 。采用JCal系統(tǒng)（http：//youngerusa.com/jcal）計(jì)算 K⁺ 通量。

以水培方式進(jìn)行低鉀脅迫處理 7d 后，取WT和MhHAK5過表達(dá)株系的植株，在烘箱中 70^°C 干燥至恒重；根長(zhǎng)采用數(shù)字尺進(jìn)行測(cè)量。將干燥的樣品研磨后用 H₂SO₄-H₂O₂ 消化，然后基于火焰光度計(jì)FP640（上海忻一精密儀器有限公司）采用火焰光度法[24]測(cè)定鉀含量。吲哚丁酸（IBA）與吲哚乙酸（IAA）采用上海通蔚生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒測(cè)定，試劑盒型號(hào)分別為s980T，s960T

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用MicrosoftExcel2019、SPSS23.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂絲海棠MhHAK5基因克隆及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用多個(gè)HAK序列推導(dǎo)的簡(jiǎn)并引物和反轉(zhuǎn)錄方法，克隆了垂絲海棠HAK的cDNA同源物，擴(kuò)增的cDNA片段長(zhǎng)度為 1830bp 。通過cDNA末端快速擴(kuò)增獲得MhHAK5基因全長(zhǎng)cDNA，其開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng) 1 695bp （圖1A），編碼518個(gè)氨基酸。MhHAK5蛋白分子量 60.05kDa ，理論等電點(diǎn)（pI）為7.45，脂肪系數(shù)為88.69，不穩(wěn)定指數(shù)47.92，疏水指數(shù)-0.34，為不穩(wěn)定的親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)（圖1B）的分析發(fā)現(xiàn)，MhHAK5具有復(fù)雜的螺旋折疊結(jié)構(gòu)，由 49.62% 的α- 螺旋 .17.76% 延伸鏈 ，5.23% （204號(hào) β -轉(zhuǎn)角和 27.39% 的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MhHAK5中存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1C）。

圖1 垂絲海棠MhHAK5基因克隆及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析2.2 垂絲海棠MhHAK5的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖2A可知，MhHAK5蛋白序列的4個(gè)P環(huán)保守位點(diǎn)的氨基酸為 Ser-Gly-Gly-Gly，3 個(gè)甘氨酸殘基分別為Gly244、Gly378和Gly480，還含有1個(gè)絲氨酸殘基（Ser119），表明MhHAK5屬于I型亞家族， P_A，P_B，P_C，P_D 環(huán)分別位于第 86～ 115.244～273.378～399.468～497 氨基酸之間，與AtHAK5類似，MhHAK5在氨基酸242與273對(duì)應(yīng)位置的第2個(gè)孔環(huán)結(jié)構(gòu)域中均含有天冬酰胺殘基（D）。系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）顯示，MhHAK5與AtHAK5、AtHAK10、OsHAK5聚在同一分支，且與AtHAK5同源性最高，相似度為 98.97% ;與鹽角草（Salicornia europaea）的 SeHAK1-1、SeHAK1-2同源性最低，相似度僅分別為 71.00% ） 65.38% 。

2.3 MhHAK5蛋白的亞細(xì)胞定位

為了對(duì)MhHAK5進(jìn)行精確的亞細(xì)胞定位，將綠色熒光（GFP）、紅色熒光（RFP）構(gòu)建MhHAK5-GFP融合體，并將其轉(zhuǎn)化到紅花煙草葉片表皮的目的細(xì)胞中。結(jié)果（圖3）顯示，對(duì)照組（GFP）中來(lái)自GFP的熒光較深且分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而在表達(dá)MhHAK5：GFP的細(xì)胞中僅觀察到細(xì)胞核明亮熒光，且瞬時(shí)表達(dá)分析表明疊加場(chǎng)中定位于細(xì)胞核內(nèi)。

圖A中 P_A-P_D 表示在P環(huán)預(yù)測(cè)的氨基酸殘基的A—D位點(diǎn)。MhHAK、SsHAK、SbHAK、NtHAK、SiHAK、VvHAK、MdHAK、TaHAK、HvHAK、OsHAK、AtHAK、IbHAK及SeHAK分別表示垂絲海棠、甘蔗、高梁、煙草、谷子、葡萄、野生蘋果、小麥、大麥、水稻、擬南芥、甘薯及鹽角草的相關(guān)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族成員。

2.4MhHAK5在不同鉀處理垂絲海棠不同組織中的表達(dá)分析

由圖4可知，MhHAK5基因在垂絲海棠不同組織中的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為根中最高，葉中次之，莖中最低。在正常供K（CK）條件下，與根相比，MhHAK5基因在葉、莖中的相對(duì)表達(dá)量分別降低16.70% ） 67.32% ，在莖中的表達(dá)量顯著低于根中而在低鉀脅迫（LK）條件下，MhHAK5在根、莖、葉中的表達(dá)量差異顯著，在葉、莖中的表達(dá)量分別低于根中 24.24% ） 46.09% 。不同鉀處理間比較，LK條件下的MhHAK5表達(dá)量高于CK，表明低K可明顯誘導(dǎo)MhHAK5基因上調(diào)表達(dá)。

柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

2.5 過表達(dá)MhHAK5的擬南芥早期株系對(duì)低K的耐受性分析

為了研究MhHAK5基因的功能，從15個(gè)過表達(dá)該基因的擬南芥株系中隨機(jī)篩選出1個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行進(jìn)一步的低K耐受性試驗(yàn)。將萌發(fā)后的WT和MhHAK5轉(zhuǎn)基因株系種子轉(zhuǎn)人分別含有 0.5mmol/L 和2mmol/L K⁺ 的Han's營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果（圖5）顯示，在2mmol/L K⁺ （CK）條件下，WT和轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，形態(tài)上沒有明顯差異；然而，在0.5mmol/L K⁺（LK） 處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的根發(fā)育均受到抑制。與CK相比，LK脅迫顯著降低WT和MhHAK5轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)和根質(zhì)量。

2.6 過表達(dá)MhHAK5的擬南芥株系 K⁺ 吸收與生長(zhǎng)激素含量分析

通過NMT技術(shù)測(cè)定缺鉀對(duì)過表達(dá)MhHAK5和野生型（WT）擬南芥根系分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū) K⁺ 通量的影響，由圖6A結(jié)果可知，無(wú)論施鉀水平如何，轉(zhuǎn)基因株系的根尖分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū) K⁺ 通量皆顯著高于 WT 。CK條件下，分生區(qū)的平均 K⁺ 通量為 -9.82μmol/（cm²?s） ，伸長(zhǎng)區(qū)的通量較其顯著提高 9.04% ;而LK條件下，分生區(qū) K⁺ 通量更高，較伸長(zhǎng)區(qū)顯著提高 299.60% ?？梢?，CK條件下，過表達(dá)MhHAK5株系和WT株系根尖均表現(xiàn)出明顯的 K⁺ 外排趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)基因根尖的 K⁺ 流出幅度顯著高于WT。

由圖6B可知，CK處理植株的鉀含量高于LK處理。CK條件下，過表達(dá)MhHAK5植株和WT植株的鉀含量無(wú)顯著差異；而LK處理下，過表達(dá)MhHAK5植株的鉀含量為 1.66% ，顯著高出WT植株0.37個(gè)百分點(diǎn)

由圖6C、D可知，低鉀處理降低野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的IBA和IAA含量，但過表達(dá)MhHAK5植株的含量高于野生型，且在LK條件下差異顯著。

3 討論

鉀（K）是垂絲海棠等砧木必需的礦質(zhì)養(yǎng)分，K⁺ 可調(diào)節(jié)滲透壓、蛋白質(zhì)生物合成及根系發(fā)育，且可有效促進(jìn)果實(shí)品質(zhì)形成[25]。 K⁺ 的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)受高親和力鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HAK）調(diào)控，大量研究表明，HAK在植物生長(zhǎng)發(fā)育、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[10]。然而關(guān)于蘋果屬HAK的生理特性及功能分析鮮有涉及。蘋果屬作為長(zhǎng)壽的自然物種，在其生命周期中經(jīng)常遭受反復(fù)的非生物脅迫，有效調(diào)控養(yǎng)分運(yùn)輸（例如鉀轉(zhuǎn)運(yùn)）對(duì)于其緩解脅迫損傷尤為重要[14，18]。本研究從蘋果屬垂絲海棠中克隆得到MhHAK5基因，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示其與擬南芥的AtHAK5、AtHAK10及水稻的OsHAK7關(guān)系最為密切；氨基酸序列分析結(jié)果顯示，其4個(gè)P環(huán)保守位點(diǎn)的氨基酸為Ser-Gly-Gly-Gly。P環(huán)保守位點(diǎn)氨基酸為Ser-Gly-Gly-Gly（I型）或Gly-Gly-Gly-Gly（Ⅱ型），是另一高親和力鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT家族的典型標(biāo)志[26]。前人研究表明，多數(shù)植物所含高親和力鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)主要分為KT/KUP/HAK超家族（以HAK為主）與HKT家族[27]，但薔薇科植物在進(jìn)化過程中HKT基因發(fā)生重大丟失，導(dǎo)致HKT家族成員數(shù)量極少[28]，如薔薇科蘋果屬蘋果種中只有1個(gè)HKT蛋白（MdHKT1）[29]。而蘋果屬海棠種在進(jìn)化過程中HAK、HKT家族經(jīng)歷著相似的基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)移，使得這兩個(gè)家族成員的功能結(jié)構(gòu)與進(jìn)化高度一致[30]，這也是本研究中MhHAK5蛋白P環(huán)保守位點(diǎn)的氨基酸為Ser-Gly-Gly-Gly的原因。此外，在氨基酸242、273的孔環(huán)結(jié)構(gòu)域位置檢測(cè)到天冬酰胺殘基，表明甘氨酸、絲氨酸可能并不是唯一的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)作用元件

HAK5是KT/KUP/HAK家族的明星基因，目前的研究表明該基因具有良好的鉀運(yùn)輸及調(diào)節(jié)活性氧分解功能[31]。本研究結(jié)果表明，MhHAK5基因全長(zhǎng) 1830bp ，ORF長(zhǎng) 1695bp ，編碼518個(gè)氨基酸。MhHAK5蛋白的分子量為 60.05kDa ，等電點(diǎn)為7.45，脂肪系數(shù)為88.69，疏水指數(shù)-0.34，不穩(wěn)定指數(shù)為47.92，是一種不穩(wěn)定的堿性親水蛋白，定位于細(xì)胞核；其二級(jí)結(jié)構(gòu)由 $＼textbf { ＼alpha - }$ 螺旋（49.62% ）、無(wú)規(guī)則卷曲（ （27.39% ）、延伸鏈（17.76%） 和 β- 轉(zhuǎn)角（ （5.23%） 組成，存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，這與Guo等[8]研究得出的HAK家族具有4＼～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的結(jié)論基本一致。

表達(dá)模式是反映基因功能強(qiáng)弱的重要表征先前的報(bào)道表明， K⁺ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平是響應(yīng)植物低 K⁺ 脅迫的兩個(gè)主要機(jī)制[32]；同時(shí)翻譯后調(diào)控，尤其是磷酸化調(diào)控，在調(diào)節(jié) K⁺ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，MhHAK5在垂絲海棠根中的相對(duì)表達(dá)量較高，且低K脅迫可誘導(dǎo)MhHAK5上調(diào)表達(dá)，這表明在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，植株根系對(duì)鉀動(dòng)態(tài)變化較敏感，低鉀可有效誘導(dǎo)MhHAK5表達(dá)。提高K轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的翻譯與后續(xù)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平是提高植物鉀素利用率的有效方法[33]。本研究將MhHAK5在擬南芥中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MhHAK5可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低K環(huán)境的耐受性。這與丁寶娟等[33]研究得出的過表達(dá)ZmHAK5可保障低鉀條件下玉米植株正常生長(zhǎng)的結(jié)果基本一致。

鉀離子的吸收與外排是影響?zhàn)B分離子生理平衡及改善低K脅迫的重要前提。前人研究顯示在水稻中過表達(dá)OsHAK5可增加 K⁺ 吸收以及鉀限制條件下的 K⁺/Na⁺ 比率，從而影響 K⁺ 外排[34]。本研究結(jié)果表明，在正常鉀水平和低鉀條件下，過表達(dá)MhHAK5擬南芥株系根尖 K⁺ 通量均顯著高于野生型（WT）植株;但正常施鉀處理?xiàng)l件下， K⁺ 表現(xiàn)為外排，而在低鉀條件下則表現(xiàn)為吸收，這可能有助于細(xì)胞維持離子平衡。植株鉀含量測(cè)定表明，低鉀條件下轉(zhuǎn)基因植株的鉀含量顯著高于WT，這證實(shí)了在缺K條件下，MhHAK5基因過表達(dá)能促進(jìn)植株對(duì) K⁺ 的吸收。這與Ding等[5]在煙草中的研究結(jié)果一致，即與WT品系相比，NtHTK1.3轉(zhuǎn)基因煙草品系具有更高的K含量。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，低鉀脅迫可顯著提高過表達(dá)MhHAK5擬南芥植株的IAA、IBA含量。前人研究表明，KT/KUP/HAK家族成員的啟動(dòng)子順式元件中包含植物激素響應(yīng)模塊，在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)可誘導(dǎo)內(nèi)源激素的合成[19，27]。因此，我們推測(cè)過表達(dá)MhHAK5對(duì)植物體內(nèi)的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)及生長(zhǎng)激素分泌具有雙重作用

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蘋果屬垂絲海棠MhHAK5基因全長(zhǎng) 1830bp ，ORF長(zhǎng) 1695bp ，編碼518個(gè)氨基酸。其編碼蛋白主要由 ∝ -螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，是一種不穩(wěn)定的疏水蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)。MhHAK5與AtHAK5、AtHAK10、OsHAK5相似性高，均屬于KT/KUP/HAK家族的I型亞家族。MhHAK5在垂絲海棠葉、莖、根中均有表達(dá)，以根中表達(dá)量最高，且受低鉀脅迫誘導(dǎo)。低鉀條件下過表達(dá)MhHAK5可顯著提高擬南芥的鉀離子通量及植株K含量，促進(jìn)生長(zhǎng)激素IAA和IBA分泌，從而保障根系發(fā)育。本研究結(jié)果可為耐低鉀蘋果砧木的基因改良與選育提供理論依據(jù)。

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