鳳凰茶產(chǎn)于我國(guó)廣東省潮州市鳳凰山區(qū)，屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物[1]，是數(shù)量繁多、香型豐富的栽培型珍稀茶樹種質(zhì)資源．但正是因?yàn)轼P凰茶品種、品系資源繁多，且主要以香型為主線將其歸類，存在同一香型中包含多個(gè)品種、品系，同型品種、品系之間的品質(zhì)參差不齊的現(xiàn)象．加之茶樹通常是通過雜交進(jìn)行育種，從而使各品種、品系之間的親緣關(guān)系混亂，本底不清，遺傳背景不明確，極大地妨礙了品種、品系之間的親緣歸類，以及育種親本的選配和種質(zhì)資源的創(chuàng)新和利用．從細(xì)胞學(xué)上對(duì)染色體的核型進(jìn)行研究分析，有助于從遺傳本質(zhì)上揭示茶樹遺傳變異性狀的表達(dá)規(guī)律、闡明其物種進(jìn)化的機(jī)制和途徑；對(duì)種間雜交和多倍體育種材料的鑒定都具有重要的參考價(jià)值.茶樹染色體的研究是從20世紀(jì)初開始的，前人鑒定出茶樹染色體在體細(xì)胞中為30條，性細(xì)胞中為15條[2-3]．近幾年對(duì)茶樹染色體的研究中發(fā)現(xiàn)了單倍體、三倍體以及四倍體[4-5]，但對(duì)潮州鳳凰茶染色體核型的研究還鮮見報(bào)道．為此，我們對(duì)7個(gè)鳳凰茶種質(zhì)進(jìn)行了核型分析，以期為潮州鳳凰茶的遺傳育種以及種質(zhì)親緣關(guān)系的研究提供細(xì)胞學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1材料

蜜蘭香、紅心沙仁、大烏葉和梅占采于潮州鐵鋪中華名茶園；桂花香和白葉采于鳳凰山區(qū)的鵬龍茶園，宋種采于南馥茶園，共7個(gè)品種（系）鳳凰茶.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

EX20型光學(xué)顯微鏡（舜禹光學(xué)科技有限公司），電熱恒溫水浴鍋（蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），纖維素（貨號(hào)：C8270）、果膠酶（貨號(hào)：P8181）、Giemsa染液（貨號(hào)：G1015）均購(gòu)置于索萊寶生物科技有限公司； 0.002mol/L 的8-羥基喹啉、甲醇和冰乙酸均為分析純?cè)噭?

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

于上午9：00-10：00摘取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的幼嫩芽尖，剝?nèi)ザ嘤嗟挠啄廴~片，將葉原基部分放入0.002% 的8-羥基喹啉在4 C 下預(yù)處理 4h～5h ，蒸餾水清洗后加入新鮮固定液（甲醇：冰乙酸 ：3：1 ）固定4h以上，切取生長(zhǎng)點(diǎn)部分及葉原基置于載玻片上，用 4% 纖維素酶和 1% 果膠酶的混合液進(jìn)行酶解 2.5h 左右，低滲 10min 后用鑷子蘸取固定液后迅速搗碎使細(xì)胞分散，過火，晾干后用 1：10 吉姆薩染液染 10min ，用自來(lái)水緩慢沖洗殘留的染液[6]．置于EX20型光學(xué)顯微鏡的100倍油鏡下進(jìn)行染色體的觀察，拍照.

1.4染色體數(shù)目確定及核型分析

每種茶樹選取30個(gè)染色體數(shù)目清晰的中期分裂相細(xì)胞，計(jì)數(shù)．從中選取3個(gè)染色體形態(tài)完整且分散良好的分裂相細(xì)胞進(jìn)行核型分析，按照染色體的大小和形態(tài)特征（主要根據(jù)著絲粒位置），來(lái)進(jìn)行染色體分組、排序和同源染色體配對(duì)．染色體核型分析參照李懋學(xué)[7]的標(biāo)準(zhǔn)，核型公式參照Levan等[8]對(duì)染色體類型的分類系統(tǒng)，核型類型參照Stebbins[9]對(duì)核型類型的分類標(biāo)準(zhǔn)，核型不對(duì)稱系數(shù)的計(jì)算參照Arano[10]的方法.

1.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Photoshop CS6進(jìn)行染色體核型圖的制作和數(shù)據(jù)的測(cè)量，用Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和與修圖工具相結(jié)合制作染色體核型模式圖[11]．利用SPSS11軟件，以平均臂比為橫坐標(biāo)，核型不對(duì)稱系數(shù)為縱坐標(biāo)，建立核型不對(duì)稱散點(diǎn)圖，同時(shí)采用DPS對(duì)7個(gè)鳳凰茶品種進(jìn)行聚類分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目及形態(tài)

對(duì)7個(gè)鳳凰茶種分別統(tǒng)計(jì)30個(gè)以上的處于分裂中期且分布較好的圖片進(jìn)行計(jì)數(shù)， 85% 以上的細(xì)胞具有相同的數(shù)目時(shí)，為該品種茶樹的染色體數(shù)目．各品種的染色體形態(tài)為圓棒狀，大小不一，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，除了梅占由45條染色體組成， 2n=45 ，是三倍體外，其他品種染色體均是30條， 2n=30 ，為二倍體，如圖1、圖2所示．根據(jù)李懋學(xué)[7]的標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用Excel2010和AdobePhotoshopCS6軟件測(cè)量染色體長(zhǎng)度，將姐妹染色單體進(jìn)行配對(duì)，并按照由長(zhǎng)到短進(jìn)行排序方式制作染色體核型圖及核型模式圖（圖1和圖2）.

2.2 染色體核型分析

由表1分析得出，7個(gè)品種鳳凰茶的染色體均靠近中部、近中部和近端部著絲點(diǎn)區(qū)，核型不對(duì)稱系數(shù)范圍在 58.94%～63.85% 之間，大小相對(duì)接近，但又略有不同．根據(jù)李懋學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，屬于中小染色體，符合普遍茶樹的標(biāo)準(zhǔn)[7]，結(jié)果見表2．通過對(duì)7個(gè)品種鳳凰茶的核型進(jìn)行分析，其中白葉和大烏葉的核型公式相同，都是 2n=2x=30=18m+10sm+2st ，初步推斷白葉與大烏葉的親緣較其它近一些.

蜜蘭香和梅占沒有明顯的近端部著絲粒（st）出現(xiàn)，長(zhǎng)臂與短臂的長(zhǎng)度差別相對(duì)較小，染色體結(jié)構(gòu)相對(duì)于其他品系的染色體結(jié)構(gòu)較為對(duì)稱．根據(jù)植物進(jìn)化的方向由對(duì)稱向不對(duì)稱的方向進(jìn)行[5]，說明蜜蘭香和梅占較其他種質(zhì)原始．7種鳳凰茶按其平均臂比由小到大的排序分別為梅占（1.47）lt;桂花香（1.56）lt;蜜蘭香（1.58）lt;白葉（1.71）lt;大烏葉（1.79）lt;紅心沙仁（1.87）lt;宋種（1.90）．平均臂比越小，染色體的對(duì)稱程度越高，就越原始．進(jìn)一步說明，梅占原始，宋種先進(jìn).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李斌[4]等研究認(rèn)為喬木型、大葉種茶樹的核對(duì)稱性較高；大、小葉種茶樹及其一些變種的核型均為2A或2B型[12]的觀點(diǎn)一致．潮州鳳凰茶種質(zhì)染色體核型較對(duì)稱，屬原始的2A型，而從福建引進(jìn)的宋種為2B型，相對(duì)于其他種質(zhì)來(lái)說進(jìn)化程度較高.

2.37種鳳凰茶的核型進(jìn)化趨勢(shì)

核型不對(duì)稱散點(diǎn)圖中，坐標(biāo)點(diǎn)接近右上方表示核型不對(duì)稱性強(qiáng)，進(jìn)化程度高．反之，坐標(biāo)點(diǎn)越靠近左下角代表其不對(duì)稱性越低，種的進(jìn)化程度相對(duì)也越低「13]．由圖3可知，7個(gè)鳳凰茶品種的不對(duì)稱性程度較大，宋種最靠圖的右上方，說明其進(jìn)化程度高，而梅占最靠圖的左下方，表明其較其它品種原始.

以核型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的聚類分析能更好地考察物種間的親緣關(guān)系[14]．本研究參照前人的方法，以染色體長(zhǎng)度比、平均臂比和核型不對(duì)稱系數(shù)為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析[15]．結(jié)果如圖4所示，鳳凰茶品種間的遺傳距離變化范圍較大，為1.1＼～25.0，表明品種間具有豐富的遺傳多樣性．當(dāng)遺傳距離約為10時(shí)，7個(gè)品種明顯分為2類，第一類包括大烏葉、紅心沙仁和宋種，這3個(gè)品種的核型不對(duì)稱系數(shù)、臂比值較大，且染色體長(zhǎng)度接近；第二類包括桂花香、梅占、白葉和蜜蘭香，這4個(gè)品種核型不對(duì)稱系數(shù)相對(duì)較小，且染色體相對(duì)長(zhǎng)度范圍和臂比值也均相對(duì)較小.

3討論

植物染色體的基數(shù)在一個(gè)屬或更高的分類群中是穩(wěn)定的，而且染色體的核型在進(jìn)化演替過程中具有一定的規(guī)律性，可以根據(jù)植物染色體核型的分型推斷不同品系的進(jìn)化程度[16]．植物界的進(jìn)化趨勢(shì)是從核對(duì)稱型向核不對(duì)稱型發(fā)展的，在系統(tǒng)演化上，古老或原始植物的核型較為對(duì)稱，而在常見衍生或進(jìn)化到更高水平的植物，核型大多數(shù)是不對(duì)稱核型[17]．潮州鳳凰茶種質(zhì)資源豐富，經(jīng)過幾百年的選育以及自然變異形成了今天的烏龍、紅茵、水仙、黃茶和色種等5個(gè)品系及近百個(gè)株系，目前課題組從染色體核型角度對(duì)7個(gè)鳳凰茶品種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鳳凰茶的核型均表現(xiàn)出不同程度的差異，7個(gè)鳳凰茶品種的進(jìn)化程度為：梅占lt;桂花香lt;蜜蘭香lt;白葉lt;大烏葉lt;紅心沙仁lt;宋種．茶樹染色體制備的樣品采用的是莖尖幼葉包裹的葉原基和生長(zhǎng)點(diǎn)部位，該部位細(xì)胞分裂能力活躍，相對(duì)于用茶樹根尖制備染色體取材容易，是該種質(zhì)制備染色體的最佳材料．后期課題組將繼續(xù)對(duì)潮州其它鳳凰茶品種（系）進(jìn)行核型分析，研究其親緣關(guān)系，為鳳凰茶優(yōu)良種質(zhì)資源篩選以及品種推廣應(yīng)用等方面提供重要的依據(jù).

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Karyotype and Cluster Analysis of Seven Fenghuang Tea Cultivars

YANG Dong-juan，GONG Xi，LIN Jin-tao，LIN Yang，LV Gui-ze，GUO Shou-jun， ZOU Xiang-hui （Collge of Life Sciences and Food Enginering，Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong， 521041）

Abstract：In this study，the leaf primordium of seven Fenghuang tea cultivars were used as experimental materials to prepare chromosome slides andanalyze karyotype characteristics via enzymolysis-assisted cell wall removal and hypotonic treatment.Cluster analysis was subsequently performed to evaluate the genetic similarity among cultivars and explore their phylogenetic relationships．The results indicated that six Fenghuang tea cultivars （Baiye，Dawuye，Guihuaxiang，Hongxinsharen，Milanxiang， and Songzhong）were diploid with 3O chromosomes and karyotype formulas classified as 2A，2A，2A， 2A，2A，and 2B，respectively.Meizhan was identified as a triploid with 45 chromosomes anda karyotype formula of 2A. The karyotype formulas were as follows：2n=2x=3O=18m+10sm+2st（Baiye and Dawuye）；2n=2x=30=20m+8sm+2st （Guihuaxiang）；2n=2x=30 =14m+14sm+2st （Hongxinsharen）; 2n=2x=30=20m+10sm （Milanxiang）；2n=2x=30=16m ¹⁺ 10sm+4st （Songzhong）；and 2n=3x=45=33m+12sm （Meizhan）.The asymmetrical karyotype coefficients ranged from 58.94% to 63.85% .Based on karyotypeevolutionary trends，Baiye，Dawuye，Guihuaxiang，Hongxinsharen，Milanxiang，and Meizhan wereinferred to represent more primitive forms，whereas Songzhong exhibited relatively advanced evolution.The clustering results showed that the seven cultivars were divided into two major categories at agenetic distance of 1O：Category I included Dawuye，Hongxinsharen，and Songzhong；Category II comprised Guihuaxiang，Baiye，Meizhan，and Milanxiang.These findings provide cytological evidence for elucidating the evolution and genetic relationships among Chaozhou Fenghuang tea cultivars .

Key words：Fenghuang tea；chromosome number；karyotype analysis；cluster analysis

責(zé)任編輯 周春娟