中圖分類(lèi)號(hào)：S656.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4440（2025）06-1050-13

Abstract：Hyperosmolarity-gate calcium-permeable channels（OSCA）playa significant role in the response of plants to abiotic stress.To elucidate the response mechanism of BnaOSCA family members under abiotic stress，this study identified 37 OSCA genes from the whole genome of Brassica napus and analyzed the gene structure，protein properties，and expresion paterns.The results showed that these 37 OSCA genes were unevenly distributed on 13 chromosomes and could bedivided intothreesubfamilies.Membersof thesamesubfamilyhadconservedgenestructuresandconserved motifs，and thepromoter regions of BnaOSCA family genes contained avariety of _cis -actingelementsrelated to abioticstressand hormoneresponses.The collinearity analysisresults indicatedthat gene loss ocurredduring theevolutionof the BnaOSCA family genes，and gene family expansion also took place.Undersaltanddrought stress，therelative expresion levelsof BnaOSCA family genes varied，indicating that BnaOSCA family genes played diferent regulatory roles inthe response to abiotic stress.This study provides a basis for further perfecting the regulatory network of BnaOSCA family genes.

Key words： Brassica napus；OSCA family genes；drought stress；salt stress；expression pattern

鈣通透性陽(yáng)離子通道蛋白OSCA（Hyperosmolar-ity-gatecalcium-permeablechannels）是一類(lèi)非選擇性通道，作為植物中首個(gè)被鑒定的滲透壓感受型鈣離子通道，在感知胞外滲透壓變化和調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1-3]

在模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）中，已鑒定出15個(gè)OSCA家族成員，這些成員具有高度保守的氨基酸序列，并攜帶與植物抗逆性相關(guān)的DUF221結(jié)構(gòu)域[45]。在大豆（Glycine max）中，已鑒定出 21個(gè)OSCA家族成員，其中 GmOSCA3.2 基因響應(yīng)干旱脅迫，干旱時(shí)在葉片、花和根系中的相對(duì)表達(dá)量上升， GmOSCA3.I 基因響應(yīng)堿脅迫[6]。在水稻（Oryzasativa）中，已鑒定出12個(gè)OSCA家族成員，在NaCl、ABA和PEG處理后，10個(gè)OSCA基因呈現(xiàn)差異表達(dá)[]。大麥（Hordeumvul-gare）中，已鑒定出14個(gè)OSCA家族成員，在干旱脅迫下，HvOSCA03HvOSCAO5和HvOSCA13相對(duì)表達(dá)量上升[8]。茄屬植物（Solanum habrochaites）中的11個(gè)OSCA家族成員能夠響應(yīng)干旱脅迫、低溫脅迫和脫落酸處理[9]。這些研究結(jié)果表明，OSCA家族在植物逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中具有重要作用。

甘藍(lán)型油菜是全球四大主要油料作物之一，其生長(zhǎng)易受到干旱脅迫、鹽堿脅迫和低溫脅迫的影響。在擬南芥、大豆、番茄[1]和辣椒[1]等植物中，OSCA已被深入研究，但甘藍(lán)型油菜BnaOSCA家族的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬利用生物信息學(xué)方法對(duì)油菜BnaOSCA家族成員進(jìn)行系統(tǒng)分析，同時(shí)探究BnaOSCA基因在鹽脅迫和干旱脅下的表達(dá)模式。

1材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從BnPIR數(shù)據(jù)庫(kù)中下載甘藍(lán)型油菜（Brassicanapus）的基因組序列、蛋白質(zhì)氨基酸序列和基因注釋文件[12]，從 EnsemblPlants（https：//plants.ensem-bl.org/index.html）獲取了白菜（Brassicarapa）和甘藍(lán)（Brassica oleracea）的基因組序列和注釋信息[13]；從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥（Arabidopsisthaliana） OSCA1-15蛋白氨基酸序列[14]

1.2 OSCA家族成員鑒定

在BnPIR數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選擬南芥AtOSCA1-15蛋白的同源氨基酸序列。利用NCBI（https：//www.nc-bi.nlm.nih.gov/cdd）和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線(xiàn)工具檢測(cè)候選序列是否含有OSCA特征的DUF221結(jié)構(gòu)域，剔除無(wú)典型結(jié)構(gòu)域的序列，最終確定甘藍(lán)型油菜OSCA家族成員。采用相同方法鑒定白菜和甘藍(lán)的OSCA家族成員。

1.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)Expasy 在線(xiàn)工具（https：//web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算BnaOSCA家族成員的相對(duì)分子量、等電點(diǎn)[15]，利用WoLFPSORT在線(xiàn)平臺(tái)（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位[16]

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用Clustal軟件對(duì)擬南芥、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的OSCA蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[17-18] 。

1.5基因結(jié)構(gòu)和保守基序鑒定

利用MEME（https：//meme-suite.org/）鑒定BnaOSCA蛋白的保守基序；利用TBtools[19]軟件獲得BnaOSCA基因結(jié)構(gòu)。

1.6基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

提取BnaOSCA基因啟動(dòng)子上游 2kb 序列，利用Plant Care（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[20]預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。

1.7 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page /NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用 SWISS-MODEL（https：//swissmod-el.expasy.org/interactive）構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.8共線(xiàn)性分析和在不同組織中的表達(dá)模式分析

利用TBtools軟件的McScanX工具分析甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)及擬南芥4種植物的OSCA基因的共線(xiàn)性關(guān)系;通過(guò)TBtools中的 K_a/K_s Calcator插件計(jì)算K_a/K_s 值。基于BnPIR數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21」，通過(guò)TBtools生成不同組織中BnaOSCA基因表達(dá)熱圖。

1.9 鹽脅迫、干旱脅迫處理

以甘藍(lán)型油菜品種中雙11號(hào)為材料，對(duì)四葉期幼苗分別進(jìn)行鹽脅迫（250mmol/LNaClHoagland溶液）和干旱脅迫（ 10% PEG60O0Hoagland 溶液）處理。分別在脅迫處理 0h，1h，2h，4h，8h，12h 和24h 取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。

1.10 RNA提取與qRT-PCR檢測(cè)

使用PlantRNApureKit試劑盒（Zomanbio公司產(chǎn)品）提取葉片總RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。使用 EasyScript@ One-Step gDNA Removaland cDNA SynthesisSuperMix 試劑盒（Transgen 公司產(chǎn)品）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)測(cè)定鹽脅迫和干旱脅迫下6個(gè)BnaOSCA基因的相對(duì)表達(dá)量。BnaOSCA4、BnaOSCA15、BnaOSCA23、BnaOSCA26、BnaOSCA31和BnaOSCA36及內(nèi)參基因BnaActin的引物信息如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1OSCA家族成員及其理化性質(zhì)

從BnPIR數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出37個(gè)甘藍(lán)型油菜的OSCA基因。如表2所示，這37個(gè)BnaOSCA基因編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為585～829aa，其中BnaOSCA9蛋白長(zhǎng)度最長(zhǎng)，BnaOSCA26蛋白長(zhǎng)度最短。BnaOSCA蛋白相對(duì)分子量為66733.61（BnaOSCA26）～ 95914.48（BnaOSCA33），等電點(diǎn)（pI）為6.94（BnaOSCA17）～9.55（BnaOSCA18）。37個(gè)BnaOSCA基因編碼的蛋白質(zhì)均定位于細(xì)胞質(zhì)膜。

2.2OSCA基因染色體定位和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

基于15個(gè)擬南芥的OSCA蛋白氨基酸序列、37個(gè)甘藍(lán)型油菜的OSCA蛋白氨基酸序列、19個(gè)白菜的OSCA蛋白氨基酸序列、17個(gè)甘藍(lán)的OSCA蛋白氨基酸序列和14個(gè)辣椒的OSCA蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。如圖1所示，102個(gè)0SCA蛋白被分為3個(gè)亞族，其中第I亞族包含7個(gè)OSCA蛋白，第I亞族包含42個(gè)OSCA蛋白，第Ⅲ亞族包含53個(gè)OSCA蛋白，同一亞族的OSCA基因同源性較高，它們可能具有相似的功能。如圖2所示，37個(gè)0SCA基因不均勻地分布在13條染色體上。A基因組中含有19個(gè)OSCA基因，其中A03和A08染色體上的OSCA基因數(shù)量較多，分別含有5個(gè)OSCA基因。C基因組中含有18個(gè)OSCA基因，其中C03染色體上的OSCA基因數(shù)量較多，含有6個(gè)OSCA基因。

A基因組來(lái)自蕓蔓屬的白菜（Brassica rapa）;C基因組來(lái)自蕓蠆屬的甘藍(lán)（Brassica oleracea）

2.3 基因結(jié)構(gòu)及保守基序

分析甘藍(lán)型油菜OSCA家族成員及編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。如圖3所示，BnaOSCA家族成員具有復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)，而親緣關(guān)系較近的BnaOSCA家族成員基因外顯子的分布和數(shù)量相似。所有BnaOSCA家族成員均含有Motif1、Motif7和Motif8這3個(gè)保守基序。其中，BnaOSCA14和BnaOSCA27分別含有5個(gè)Motif，而B(niǎo)naOSCA7含有7個(gè)Motif，其余成員則含有8＼～10個(gè)Motif。親緣關(guān)系較近的BnaOSCA家族成員保守基序的分布也具有相似性。

2.4 順式作用元件

采用PlantCARE工具對(duì)OSCA家族成員啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行分析。如圖4所示，啟動(dòng)子區(qū)域包含多種激素響應(yīng)元件，包括赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif、P-box）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif/CGTCA-motif）。有34個(gè)OSCA家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域含有GARE-motif響應(yīng)元件，32個(gè)OSCA家族成員的啟動(dòng)子含有ABRE響應(yīng)元件，32個(gè)OSCA家族成員含有P-box響應(yīng)元件，21個(gè)OSCA家族成員含有TGACG-motif/CGTCA-motif響應(yīng)元件。此外，在啟動(dòng)子區(qū)域還鑒定出與非生物脅迫響應(yīng)元件，包括干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)、低溫響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件。表明BnaOSCA家族的成員可能參與非生物脅迫響應(yīng)和激素調(diào)控。

2.5蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

如表3所示，37個(gè)BnaOSCA家族成員蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)都由 α -螺旋 47.65%～59.83% ） B 折疊0 1.24%～4.46% ）延伸鏈 （9.99%～15.57% ）和無(wú)規(guī)則卷曲（ 27.18%～38. 10% ）構(gòu)成。其中， α? -螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占比較高。如圖5所示，BnaOSCA家族成員的空間構(gòu)象以 α -螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，同時(shí)含有少量的延伸鏈和 β -折疊。

2.6 共線(xiàn)性分析

如圖6所示，對(duì)甘藍(lán)型油菜OSCA基因進(jìn)行共線(xiàn)性分析，共鑒定出60對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)?。除A02、A04、A10、C02和C07這5條染色體外，其余14條染色體上均存在片段重復(fù)序列，這些重復(fù)序列可能與基因家族的演化有關(guān)，表明基因重復(fù)是甘藍(lán)型油菜OSCA基因擴(kuò)增和演化的重要機(jī)制。為了解析OSCA家族基因的演化歷程，本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥4種植物OSCA家族基因進(jìn)行共線(xiàn)性分析。如圖7所示，擬南芥與甘藍(lán)型油菜之間存在51對(duì)共線(xiàn)性O(shè)SCA基因，甘藍(lán)型油菜與白菜之間存在29對(duì)共線(xiàn)性O(shè)SCA基因，甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)之間存在25對(duì)共線(xiàn)性O(shè)SCA基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)中分別含有25個(gè)、16個(gè)和16個(gè)與擬南芥OSCA基因同源的基因。值得注意的是，在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)中均未發(fā)現(xiàn)與擬南芥AT3G01100.1基因同源的基因，該基因可能在進(jìn)化過(guò)程中丟失，其功能可能已被其他基因代償[22-23]。

此外，甘藍(lán)型油菜和白菜之間存在62對(duì)共線(xiàn)性O(shè)SCA基因，其中，17個(gè)甘藍(lán)型油菜OSCA基因在白菜中存在對(duì)應(yīng)的同源基因。在甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)之間存在62對(duì)共線(xiàn)性O(shè)SCA基因。其中，17個(gè)甘藍(lán)型油菜OSCA基因在甘藍(lán)中存在對(duì)應(yīng)的同源基因。這些結(jié)果表明，在白菜和甘藍(lán)雜交形成甘藍(lán)型油菜的過(guò)程中，伴隨著基因丟失的事件。此外，盡管甘藍(lán)型油菜基因組中存在OSCA基因丟失現(xiàn)象，但OSCA家族卻發(fā)生了擴(kuò)張，表明基因復(fù)制在物種進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

2.7BnaOSCA基因在不同組織中的表達(dá)模式

從BnTIR平臺(tái)下載中雙11號(hào)甘藍(lán)型油菜在不同組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。如圖8所示，BnaOSCA26、BnaOSCA31BnaOSCA33和BnaOSCA36在葉和角果中的相對(duì)表達(dá)量較高，BnaOSCA8和BnaOSCA30在根、葉、子葉、芽、萼片、花瓣、花粉、長(zhǎng)角果、種子中均不表達(dá)，而大部分BnaOSCA基因只在某些組織中的相對(duì)表達(dá)量較高，表現(xiàn)為組織特異性表達(dá)。

2.8非生物脅迫下BnaOSCA基因的表達(dá)

基于BnaOSCA家族基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，篩選出在葉中相對(duì)表達(dá)量較高的6個(gè)BnaOSCA基因，進(jìn)一步分析其在鹽脅道、干旱脅迫下甘藍(lán)型油菜葉中的相對(duì)表達(dá)量。如圖9所示，BnaOSCA4、BnaOSCA23和BnaOSCA26相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在鹽脅迫 ^2h ，BnaOSCA4、BnaOSCA23和BnaOSCA26相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。在鹽脅迫 ¹h BnaOSCA15BnaOSCA31和BnaOSCA36相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。如圖10所示，干旱脅迫 1h，BnaOSCAI5.

BnaOSCA23和BnaOSCA36相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。干旱脅迫 12h，BnaOSCA4 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高；干旱脅迫 4h，BnaOSCA26 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。

3 討論與結(jié)論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常面臨干旱、低溫、鹽堿脅迫以及病原體侵染等多種逆境脅迫[24]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了快速感知和應(yīng)對(duì)逆境的耐受和規(guī)避機(jī)制[1]。OSCA（鈣通透性陽(yáng)離子通道蛋白）在鈣信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。目前，已在擬南芥、大豆、大麥和茄屬植物中分別鑒定出15個(gè)、21個(gè)、14個(gè)和11個(gè)OSCA家族成員，這些成員均具有DUF221結(jié)構(gòu)域。本研究從甘藍(lán)型油菜基因組中鑒定出37個(gè)OSCA家族基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)具有高度保守的氨基酸序列特征，且大多數(shù)含有與植物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的DUF221結(jié)構(gòu)域。

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，BnaOSCA家族基因可以被劃分為3個(gè)亞族。這37個(gè)BnaOSCA基因在13條A基因組來(lái)自蕓墓屬的白菜（Brassica rapa）;C基因組來(lái)自蕓墓屬的甘藍(lán)（Brassica oleracea）。

染色體上不均勻分布，其中，A基因組包含19個(gè)BnaOSCA基因，而 c 基因組則包含18個(gè)BnaOSCA基因。本研究還鑒定了甘藍(lán)型油菜的二倍體祖先物種——白菜和甘藍(lán)的基因組，分別鑒定出19個(gè)和17個(gè)OSCA家族成員。共線(xiàn)性分析結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜OSCA家族基因在進(jìn)化過(guò)程中存在基因丟失現(xiàn)象，同時(shí)也發(fā)生了基因擴(kuò)張。BnaOSCA家族表現(xiàn)出進(jìn)化保守性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能連續(xù)性[25]

研究結(jié)果表明，OSCA基因在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[26。在鹽脅迫下，玉米ZmOSCA2.3.ZmOSCA2.4 表達(dá)量可提高200倍，且與脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)。在干旱脅迫下，擬南芥中 ZmOSCA2.4 的表達(dá)量上升[26]。水稻OsOSCA1.2和 OsOSCA2.2 在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界滲透壓變化的響應(yīng)過(guò)程中，受到晝夜節(jié)律的影響，OsOSCA基因還響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫[27-28]。綜上，OSCA家族基因在響應(yīng)植物的非生物脅迫中具有重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜BnaOSCA家族基因中含有大量的逆境響應(yīng)元件，這些元件可能通過(guò)不同激素信號(hào)通路調(diào)控油菜生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)。本研究對(duì)部分OSCA家族基因在鹽脅迫、干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，BnaOSCA4、BnaOSCA23和BnaOSCA26相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在鹽脅迫 2h，BnaOSCA4，BnaOSCA23 和BnaOSCA26相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。在鹽脅迫 1h，BnaOSCAI5，BnaOSCA3I 和BnaOSCA36相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。干旱脅迫 ^1h BnaOSCA15、BnaOSCA23和BnaOSCA36相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。干旱脅迫 12h，BnaOSCA4 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大;干旱脅迫 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大。表明BnaOSCA家族基因在甘藍(lán)型油菜響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步完善BnaOSCA家族基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）