1 引言

榴蓮（DuriozibethinusMurr.）是木棉科榴蓮屬熱帶果樹，果實(shí)氣味濃烈，味道獨(dú)特，被譽(yù)為“水果之王”[。榴蓮富含蛋白質(zhì)、脂類和氨基酸，是良好的果品類營養(yǎng)來源，具有很好的保健功能[2-3]。榴蓮原產(chǎn)于婆羅洲、蘇門答臘等地，400年前被引種到印度至新幾內(nèi)亞的廣袤地區(qū)，現(xiàn)為泰國、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓、越南和緬甸等東南亞諸國廣為種植。

我國是重要的榴蓮進(jìn)口國和消費(fèi)國，榴蓮產(chǎn)業(yè)在我國潛力很大[4]。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平不斷提高，我國鮮榴蓮進(jìn)口量逐年增加，2023 年進(jìn)口量為142.59萬噸，進(jìn)口額達(dá)67.16億美元[5]。榴蓮的國產(chǎn)化種植有助于減輕進(jìn)口依賴，可為鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興帶來重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。除臺(tái)灣省外，海南省是我國唯一引種榴蓮成功的省份[]。榴蓮生長需要年均溫度 22° 以上、年降雨量1000毫米以上的氣候條件，海南省北緯 19^° 以南的三亞、樂東、保亭和陵水等市縣較適宜榴蓮種植[]。海南省榴蓮產(chǎn)業(yè)處于剛剛起步階段，品種缺乏自主性，存在面積小、產(chǎn)量低、配套栽培技術(shù)欠缺等諸多問題，市場需求與產(chǎn)業(yè)薄弱矛盾突出。要發(fā)展海南榴蓮產(chǎn)業(yè)，首先要大力引進(jìn)榴蓮種質(zhì)資源，開展精準(zhǔn)鑒定和評(píng)價(jià)。本研究對越南、泰國、馬來西亞引進(jìn)及自主創(chuàng)制的99份榴蓮種質(zhì)資源開展了二代全基因組測序，進(jìn)行了變異位點(diǎn)挖掘和群體進(jìn)化分析，為榴蓮育種方法和育種理論研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，有助于榴蓮自主優(yōu)秀品種選育。

2 數(shù)據(jù)采集與處理方法

2.1材料

本研究所用榴蓮種質(zhì)資源共計(jì)99份，于2024年2月一3月采自海南省三亞，選取新梢幼嫩葉片，于-75^°C 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品名稱、采樣地點(diǎn)、來源和特征如表1所示。

2.2 DNA提取

采用CTAB法進(jìn)行DNA提取，用超純水稀釋至50ng/μl ， -20^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3文庫構(gòu)建與測序

每個(gè)樣品使用 0.2μg 的DNA作為文庫制備的輸入材料。根據(jù) Rapid PlusDNALib Prep Kit for Ilumina（RK20208）試劑盒說明書的要求，將基因組DNA樣品通過超聲波打斷至350bp大小。然后對DNA片段進(jìn)行末端修飾、A尾加尾，并與Illumina測序的全長接頭連接，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過AMPure XP 系統(tǒng)（Beckman Coulter，Beverly，美國）純化后，使用Qubit 3.0熒光計(jì)（Invitrogen，美國）測量DNA濃度，文庫通過Agilent2100生物分析儀分析大小分布，并通過實(shí)時(shí)PCR定量（204 ）。索引編碼樣品的聚類在cBotClusterGeneration System 上使用 Illumina PE Cluster Kit（Illumina，美國）按照說明書進(jìn)行。聚類生成后，DNA文庫在IlluminaHiSeqXTen平臺(tái)上進(jìn)行測序，生成150bp的雙端讀長（paired-endreads）。下機(jī)數(shù)據(jù)已經(jīng)提交到國家基因組數(shù)據(jù)中心（NGDC），檢索號(hào)：PRJCA027184和PRJCA026560。測序數(shù)據(jù)量共計(jì)約1.62Tb，平均每份資源測序數(shù)據(jù)量15.6Gb。

2.4測序數(shù)據(jù)比對與變異位點(diǎn)挖掘和注釋

采用fastp軟件[8使用默認(rèn)參數(shù)對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到的cleanreads以‘干堯’榴蓮基因組序列hapl.chromosome.fasta（https：//doi.org/10.57760/sciencedb.agriculture.00013）為參考序列文件進(jìn)行比對，使用軟件為bwa-mem，使用 samtools flagstat命令[9]對比對情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。之后，用samtoolssort命令對bam文件進(jìn)行排序，用 gatk MarkDuplicates 命令[10]對PCR重復(fù)序列進(jìn)行標(biāo)記。再用gatkHaplotypeCaller命令對每一個(gè)樣品進(jìn)行獨(dú)立的變異位點(diǎn)挖掘，并用gatkCombineGVCFs命令將99個(gè)樣品的gvcf文件進(jìn)行合并，使用gatkGenotypeGVCFs命令得到vcf文件。變異位點(diǎn)注釋使用snpEff軟件[11]，參考注釋文件為hapl.gene_annotation.gff3 （https：//doi.org/1o.57760/sciencedb.agriculture.0oo13）。

2.5 群體進(jìn)化分析

使用plink2軟件[12]對vcf文件進(jìn)行過濾，參數(shù)為--mind 0.10--maf0.05--geno 0.05--hwe0.0001--recodevcf'id-paste=iid'--allow-extra-chr--set-missing-var-ids@ ：# --indep-pairwise 5010 0.2，并使用vcf2phylip.py腳本生成phy文件，用FastTreeMP軟件[13]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，并用iTOL軟件（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行可視化。使用plink2軟件對過濾后的vcf文件進(jìn)行PCA分析，并使用ggplot軟件進(jìn)行繪圖。使用admixturePipeline軟件[14]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，參數(shù)為-k1-K10-n16-t100-a0.05 。使用plink軟件進(jìn)行IBS距離矩陣計(jì)算，并使用pheatmap軟件進(jìn)行可視化。使用vcftools 軟件[15]計(jì)算 Tajima'sD和 π 值。使用PopLDdecay軟件[進(jìn)行LD分析。

3 數(shù)據(jù)內(nèi)容

3.1原始數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)集

測序樣品數(shù)量總計(jì)99份，其中僅干堯樣品為高深度測序（ gt;50× 覆蓋度），其余98份樣品為中深度測序，測序數(shù)據(jù)量共計(jì)約 1.62T ，中深度平均每份資源測序數(shù)據(jù)量 15.4Gb ，榴蓮基因組大小約 750Mb ，約20.5× 覆蓋度（表2）。

3.2數(shù)據(jù)比對和變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)集

測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對率為 78.49%- 96.75% ，平均值為 92.12% ，但也存在低于 80% 的種質(zhì)資源2份（圖1）。共檢測到54974697個(gè)變異位點(diǎn)，過濾掉低質(zhì)量的位點(diǎn)后剩余53155367個(gè)，共包括SNP、INS和DEL三種變異類型（表3），其中SNP個(gè)數(shù)最多，占 86.7% 。榴蓮基因組中28條染色體對應(yīng)的變異位點(diǎn)個(gè)數(shù)為1111713一3599733，平均每13個(gè)堿基有1個(gè)變異位點(diǎn)（表4）。變異位點(diǎn)注釋結(jié)果表明變異位點(diǎn)位于基因間的占比最高（ 70.23% ），其次是位于基因上游序列（ 11.51% ）或下游序列（ 12.48% ），位于基因外顯子和內(nèi)含子的較少，分別有 1.38% 和 3.60% 0

3.3群體進(jìn)化分析

由圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，99份榴蓮資源共聚為三個(gè)大的分支，或者稱為亞群，Group1包括27份資源，Group2包括28份資源，Group3包括44份資源，群體結(jié)構(gòu)和主成分分析結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。由圖3可以看出，有一些品種的親緣關(guān)系是很近的，比如紅榴蓮和LSA01，這兩個(gè)單株都是紅肉類型的，又比如WX006和WX006-1，又比如D163-8499、D160-8478、D101-8454、D166-8424、Xianhung-8411、Lipanbara-8383、D99-8362、D175-8357、D198-8276、Maharani-8280、Tembaga-8221、S.O-8212、D226-8146、D1-8183、D24-8133、D206-8100、D15-8119、BungeM.KK-8104、D155-8087、SYZ01MSW、SYZ02TMN、

SYZ208、LW02HC，又比如黑刺和SYZ412，又比如金枕、SD033、SY014、SYZ03HC、SYZ04JZ、LW01JNK，又比如WN01、WN02、WN06、WN03、WN04、WN05、WNX02，又比如SYZ06HR、SYZ08LL、SYZ10TLZ、SYZ12CB。

由圖2的LD衰減圖可以看出，榴蓮的LD衰減很快，LD系數(shù)降低到最大值的一半的衰減距離只有0.1-0.2kb ，最大LD系數(shù)僅0.15，說明榴蓮的遺傳多樣性是比較豐富的，也沒有發(fā)生長期的馴化。3個(gè)亞群的衰減距離相似，均小于總?cè)后w衰減距離，這可能是由于群體大小引起的。

Fst是分化系數(shù)，從0到1說明親緣關(guān)系越來越遠(yuǎn)，由圖2可以看出，三個(gè)亞群的親緣關(guān)系都比較近，group2和group3的親緣關(guān)系最近，其次是group1和group3。核苷酸多樣性 π 值越大說明核苷酸多樣性越高，越低說明兩個(gè)座位DNA序列差異越小，由圖2可以看出，三個(gè)亞群的核苷酸多樣性比較接近，group2最高，groupl最低。Tajima'sD是選擇相關(guān)的參數(shù)，大于0代表群體觀測雜合度高于預(yù)期雜合度，稀有等位基因頻率降低（群體收縮或者平衡選擇），小于0說明群體觀測雜合位點(diǎn)少于預(yù)期值，稀有等位基因頻率增加（群體擴(kuò)張或者低頻選擇），由圖2可以看出，三個(gè)亞群的Tajima'sD均大于0，說明均發(fā)生了群體收縮，groupl最大，group3最小，這可能與群體數(shù)量較少有關(guān)。

統(tǒng)進(jìn)化分析；B.主成分分析；C.群體結(jié)構(gòu)分析；D.LD、Fst、Tajima'sD和 π 值計(jì)算

APhylogenticais;ipalCptAis;CpatiStructuealyis;DClatiofsta'sdue Groupl：MahanWang，WX00，WX06-，6-84996-84780-845466-844Xianug-8411ipanbara-839-86 D175-8357，98-876aara-8280mbg-821，O226-846-8D4-83，D-815-819g814 D155-8087，SYZ0W，Z02N，Z208，YZ05，LW02HC;Group2：WX00，LN012，LN11N13，LY10，L13，L125， LNY2，LNC6，LNC7，LNC4，LNY1，LNC2，LNC5，LNY6，LNY14，LNC1，LNY4，LNC3，LNY8，LNY18，LNY16，LY11，L9，LY21， LNY20，LNC8；Gou3：HeiCiYueNanYeaoJZhen，HogLuianWX009，WX00WX008，Gaao0，D3714015 SY1-3，SD1-1，Y1-4，SY1-1，D-4，S1-2，SD-3，WN0，WN02，WN06，WN03，WN04，WN5，SYZ03HC，YZ412，YZ04JZ06H， SYZ07NTC，SYZ08LLYZ10，YZ11LK，Z12CB，LW01JK， WNX02，DO1，01A，D02B，S04D，D03C，05E， YML01，LSA01

4質(zhì)量控制和技術(shù)驗(yàn)證

DNA質(zhì)量評(píng)估通過以下三種方法結(jié)合來驗(yàn)證分離的基因組DNA質(zhì)量：1、在 1% 瓊脂糖凝膠上監(jiān)測DNA降解和污染情況；2、使用Nanodrop檢測OD260/280比值以檢查DNA純度；3、通過Qubit ?_?（?） 3.0熒光計(jì)（Invitrogen，美國）使用Qubit ?_?（?） DNA測定試劑盒測量DNA濃度。下機(jī)數(shù)據(jù)使用fastp軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)控。下機(jī)數(shù)據(jù)使用fastp軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，Q20在 94% 以上，Q30在 85% 以上，表明測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

5數(shù)據(jù)價(jià)值與使用建議

本研究提供了99份種質(zhì)資源的WGS測序數(shù)據(jù)和變異位點(diǎn)信息，可用于開展榴蓮群體遺傳學(xué)、分子標(biāo)記開發(fā)、榴蓮育種方法和育種理論等研究。

6數(shù)據(jù)可用性

開放訪問，遵從CCBY-NC4.0協(xié)議。

https：//cstr.cn/17058.11.sciencedb.agriculture.00077;

https：//doi.org/10.57760/sciencedb.agriculture.00077。

7代碼可用性

本論文分析所用代碼請查閱https：//github.com/CAASoooJXH/Durian_Population_Genetics_Code

8數(shù)據(jù)作者分工職責(zé)

冀曉昊，論文撰寫。

冀曉昊、時(shí)夢和王瑩瑩，數(shù)據(jù)分析。

冀曉昊和時(shí)夢，DNA提取和測序。王孝娣和鐘義旺，數(shù)據(jù)質(zhì)量控制。

鄭道君和謝圣華，樣品采集。

劉鳳之、馮學(xué)杰和王海波，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文構(gòu)架。

倫理聲明

本研究未涉及倫理。

利益沖突聲明

作者聲明，全部作者均無會(huì)影響研究公正性的財(cái)務(wù)利益沖突或個(gè)人利益沖突。

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7（2）：227-237.DOI： 10.19788/j.issn.2096-6369.100040. CITATION：JIXiaoHao，ZHENGDaoJun，XIEShengHua，SHeng，ZHONG YiWangWANG YngYing，WANG XiaoDiLUengZhi，ENGXueJie WANG HiBoVantSitetsetof9uribeuspasRsousJ]JalofgiculturaligDta72）：10.19788/j.issn.2096-6369.100040.

Abstract：Durianhashigheconomicandnutrionalvalue.InChina，thedurianindustryishighlydependentonimportsThedurian industryiHianoceisiancyaceedyitedceage，oeldompleteleotroudi lackofself-suiecyandinsuicentsupporingculivationtchquesTeseiusladtoastarkonrastbetwngharket demandadaweak industry.Thereisanurgentneedforthecolection，identification，andevaluationofduriangermplasmresoures. Inthis study，DNAwasextractedfrom99duriangermplasmresources.Librarieswereconstructed，andsecond-generation whole-genomesequencingwasperformed.Bioinformaticanalyses，includingqualitycontrolofsequencingdata，variantsite discoveryandanmotation，andpopulationevolutionstudies，wereconductedothesequencingdata.Thetotalamountofseqencing data was 1.62Tb ，yielding 54，974，697variant sites，including SNPs，insertions （INS），anddeletions （DEL），with SNPsbeinghe most prevalent.Onaverage，there isone variant site per13basesinthedurian genome.Thesevariant sites are mainlylocatedin intergenicregions，withfewer ingeneexonsandintrons.The99durianresoucescanbedividedintothreesubgroups.Thedistance atwhich theLDcoefficient decaysto half itsmaximum value is only 0.1-0.2kb ，indicatingrich genetic diversity.Thisstudyprovides genomesequencingdata and variant siteinformation for99 durian germplasmresources，ofering fundamental data supportfor durian genetics，bredingmethods，andbreeding theoryresearch.Thiswillaidintheselectionandbreedingofdurianvarieties in Hainan and worldwide.

Keywords： durian; variant sites; SNP; population evolution