中圖分類(lèi)號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2096-3998（2025）03-0016-09

摘要：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作為一種食品級(jí)的安全菌株，是表達(dá)外源蛋白的優(yōu)良宿主?；谌殒溇淖晕艺T導(dǎo)表達(dá)機(jī)制改造獲得的乳酸乳球菌NICE表達(dá)系統(tǒng)具有誘導(dǎo)效率高、自身分泌蛋白少、無(wú)胞外蛋白酶等特點(diǎn)，已被廣泛用于表達(dá)各類(lèi)外源蛋白。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的表達(dá)元件，實(shí)現(xiàn)外源蛋白在胞內(nèi)、胞外或細(xì)胞表面錨定表達(dá)，從而發(fā)揮蛋白質(zhì)作為抗原、抗菌肽或作為酶制劑的生物學(xué)功能。綜述了NICE表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制，總結(jié)了重組乳酸乳球菌在食品工業(yè)和黏膜疫苗等領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，為乳酸乳球菌NICE表達(dá)系統(tǒng)未來(lái)的應(yīng)用方向提供參考。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一種公認(rèn)的安全微生物，廣泛存在于自然界[1]。近年來(lái)對(duì) L. lactis 的研究表明其生理、生化和遺傳背景等較為清楚，具有非致病性、易分離培養(yǎng)、分泌蛋白能力強(qiáng)等特性，并且 L ：lactis自身能分泌到細(xì)胞外的蛋白主要是Usp45，通過(guò)分子生物學(xué)工具對(duì)其進(jìn)行特定的改造，使其成為異源蛋白表達(dá)和分泌的理想宿主，可以作為基因工程的模式菌[2-3]。研究表明改造后的 L. lactis具有組成型和誘導(dǎo)型兩類(lèi)不同的表達(dá)方式，組成型表達(dá)不受外界因素影響可持續(xù)表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)由于其啟動(dòng)子更易于控制而備受青睞。目前已開(kāi)發(fā)出糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[4] pH 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[5] ?Zn²⁺ 控制表達(dá)系統(tǒng)[6]等。目前乳鏈菌肽控制的（Nisin Controlled gene Expression，NICE）表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用較為廣泛，該系統(tǒng)基于天然的乳鏈菌肽（nisin）基因簇中自我誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制改造得到的，已有研究通過(guò)NICE系統(tǒng)表達(dá)酶、外源抗原、細(xì)胞因子等多種類(lèi)型的外源蛋白[7-9]。本文主要針對(duì)NICE 表達(dá)系統(tǒng)在食品冷凍儲(chǔ)藏、食品發(fā)酵、生物降解以及粘膜疫苗開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)NICE表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)過(guò)程的挑戰(zhàn)提出應(yīng)用展望。

1乳酸乳球菌NICE表達(dá)系統(tǒng)概述

乳鏈菌肽（nisin）是L.lactis產(chǎn)生的由34個(gè)氨基酸組成的一種短肽，最初發(fā)現(xiàn)其具有廣譜抑菌作用，并且對(duì)人安全無(wú)毒害，作為食品防腐劑在食品保鮮和貯藏領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[10]。nisin 的表達(dá)由11個(gè)基因調(diào)控（圖1），包括編碼nisin前體的nisA基因和調(diào)節(jié)nisin基因表達(dá)的nisK和nisR以及其他控制 nisin修飾、轉(zhuǎn)位、加工和對(duì) nisin免疫的基因[11]。NisK 是一種存在于細(xì)胞膜上的組氨酸蛋白激酶，當(dāng)成熟的nisin和NisK結(jié)合時(shí)會(huì)將NisK磷酸化并自動(dòng)將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)調(diào)節(jié)因子NisR，激活的NisR可誘導(dǎo)nisin基因簇中3個(gè)啟動(dòng)子中的2個(gè)轉(zhuǎn)錄： P_nisA 和 P_nisF ，而驅(qū)動(dòng)NisK和NisR表達(dá)的啟動(dòng)子不受影響?；谌殒溇淖晕艺T導(dǎo)機(jī)制，通過(guò)基因工程手段將NisK和NisR基因插人到乳酸乳球菌亞種MG1363的染色體上，得到NZ9000菌株，將啟動(dòng)子 P_nisA 克隆在質(zhì)粒上，獲得pNZ8148質(zhì)粒，將目的基因克隆在啟動(dòng)子 P_nisA 下游，通過(guò)加入一定濃度的nisin來(lái)誘導(dǎo)該基因的表達(dá)[12]。而食品級(jí) NZ3900/pNZ8149 表達(dá)系統(tǒng)則是以lacF基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，lacF缺陷型L.lactisNZ3900作為宿主，通過(guò)乳糖進(jìn)行篩選。

表達(dá)外源蛋白時(shí)根據(jù)蛋白的不同功能和作用方式可構(gòu)建不同的表達(dá)方式，基于外源蛋白表達(dá)位置的不同分為胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)和細(xì)胞表面錨定表達(dá)[13-14]。

（1）胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白是最基本的表達(dá)方式，研究人員通過(guò)重組L.lactis胞內(nèi)表達(dá)幽門(mén)螺旋桿菌、3型鴨甲肝病毒、口蹄疫病毒等病原微生物的抗原蛋白開(kāi)發(fā)粘膜疫苗，探究其免疫效果。張丹雨等[15]通過(guò)NICE系統(tǒng)表達(dá)了乙醛酸脫氫酶，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，提高了可溶蛋白表達(dá)比例，且安全系數(shù)更高，但酶活力略低。雖然胞內(nèi)表達(dá)的構(gòu)建和檢測(cè)相較于分泌表達(dá)和表面錨定表達(dá)更簡(jiǎn)單，然而這種表達(dá)方式還存在一定的局限性，表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量積存而增加被降解的概率，作用于機(jī)體時(shí)，目的蛋白必須等待細(xì)胞裂解才能釋放，對(duì)外源蛋白的作用效率存在影響。

（2）分泌表達(dá)是在胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上對(duì)目的蛋白和分泌信號(hào)肽進(jìn)行融合表達(dá)， SP_usp45 是 L .lactis的主要分泌蛋白[16]。成熟的目的蛋白和N端信號(hào)肽組成的前體蛋白在信號(hào)肽（SP）引導(dǎo)下，目的蛋白通過(guò)Sec轉(zhuǎn)運(yùn)酶作用被跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。作用機(jī)制如圖2所示。異源蛋白的分泌分為3個(gè)階段： ① 細(xì)胞質(zhì)中的早期分泌步驟，包括前體的合成和靶向轉(zhuǎn)位機(jī)制； ② 前體蛋白通過(guò)SEC轉(zhuǎn)運(yùn)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及信號(hào)肽切割； ③ 蛋白質(zhì)質(zhì)量的控制，包括過(guò)量合成或降解。分泌表達(dá)可以對(duì)宿主菌株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，避免了胞內(nèi)表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的目的蛋白在胞內(nèi)積存導(dǎo)致細(xì)胞代謝壓力過(guò)大等問(wèn)題，提高了蛋白的產(chǎn)量并且簡(jiǎn)化了純化步驟。目前已通過(guò)分泌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出PlnF抗菌肽、細(xì)菌素Paracin1.7、雙肽細(xì)菌素Plantaricin EF等一些具有抗菌活性的蛋白，同時(shí)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域利用該系統(tǒng)獲得可用于疫苗佐劑開(kāi)發(fā)的雞白細(xì)胞介素，以及食品行業(yè)中干酪生產(chǎn)過(guò)程所需用到的牛凝乳酶等多種外源蛋白。

（3）細(xì)胞表面錨定表達(dá)將L.lactis表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用提升到一個(gè)新的領(lǐng)域，外源蛋白通過(guò)共價(jià)附著在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上，或者通過(guò)非共價(jià)連接具有與細(xì)胞壁或細(xì)胞膜強(qiáng)烈相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域[17]。其中共價(jià)結(jié)合方式中所用的錨定結(jié)構(gòu)域主要包括跨膜錨鉤、脂蛋白錨鉤、LPXTG錨鉤等，LysM錨定結(jié)構(gòu)域?qū)儆诜枪矁r(jià)結(jié)合，可以將融合蛋白結(jié)合到菌體表面。具有表面展示重組蛋白的L．lactis應(yīng)用于許多生物技術(shù)中，展示蛋白質(zhì)的 L ：lactis可以作為生物吸附劑、生物傳感器和口服疫苗等（圖3）。Plavec等[18]研究了常用的含有L.lactis賴(lài)氨酸基序（LysM）的表面錨定結(jié)構(gòu)域，并篩選了15個(gè)L.lactis 或噬菌體起源的錨定結(jié)構(gòu)域，證明了L.Lactis中不同蛋白錨定結(jié)構(gòu)域的有效利用。

2乳酸乳球菌NICE表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

NICE 表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、誘導(dǎo)效率高并且嚴(yán)格可控，目前已構(gòu)建重組L.lactis表達(dá)酶類(lèi)、細(xì)胞因子、抗原等多種外源蛋白[19-21]。由于該表達(dá)系統(tǒng)具有食品級(jí)并且宿主菌在腸道具有優(yōu)良的黏附特性，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料的生產(chǎn)，生物降解以及粘膜疫苗等領(lǐng)域[22]。

2.1在食品工業(yè)生產(chǎn)中的研究進(jìn)展

甜味蛋白作為一種理想的糖類(lèi)候選替代物，可以通過(guò)生物工程技術(shù)大量表達(dá)應(yīng)用于酸奶制造替代糖或甜味劑的添加，以降低酸奶制造中原材料的使用。目前已通過(guò)大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)甜味蛋白Brazzein，但其產(chǎn)物的甜味和表達(dá)量不足以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。王長(zhǎng)遠(yuǎn)等[23]通過(guò)NICE表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表面展示Brazzein的重組L.lactis，經(jīng)純化后重組蛋白占總蛋白量的 94% 。蒲元浩等[24]將葡聚糖蔗糖酶DsrB與SP45分泌信號(hào)肽融合表達(dá)，葡聚糖產(chǎn)量為 10.54g/L 。張振葉[2]成功構(gòu)建了三株表達(dá)纖維素酶的重組L.lactis，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩株的酶活力均高于組成型表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照組。張艷麗等[25]利用NICE表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了具有優(yōu)良凝乳特性的牛凝乳酶原，為奶酪的加工提供了新的思路。通過(guò)重組 L. （204號(hào)lactis表達(dá)抗凍蛋白在冷凍食品的加工和儲(chǔ)藏、細(xì)胞保藏、抗凍農(nóng)作物的栽培等方面均有應(yīng)用，已有研究在L.lactis 中表達(dá)抗凍蛋白處理冷凍肉[26-27]，發(fā)現(xiàn)可以降低冷凍肉中水分的流失和蛋白損失。張莉等[28]利用 L lactis表達(dá)抗凍蛋白SF-P進(jìn)一步對(duì) L ：lactis表達(dá)抗凍蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白在L.lactis 中的表達(dá)有效降低了冷凍脅迫對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，為凍干粉的開(kāi)發(fā)提供了新的技術(shù)方法。細(xì)菌素具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性、耐酸、耐高溫等特點(diǎn)，作為天然防腐劑在食品工業(yè)方面具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力，目前通過(guò)L.lactis 表達(dá)的細(xì)菌素多具有良好抑菌效果。酈萍等[31成功構(gòu)建表達(dá)PlnE和PlnF的重組L.lactis發(fā)現(xiàn)該抑菌素不僅能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，還能抑制革蘭氏陰性菌，同時(shí)PInEF具有協(xié)同效應(yīng)。NICE表達(dá)系統(tǒng)在食品工業(yè)中的研究見(jiàn)表1。

2.2在粘膜疫苗領(lǐng)域的研究進(jìn)展

近年來(lái)粘膜疫苗抗原傳遞系統(tǒng)成為傳染病防御領(lǐng)域的熱點(diǎn)，特別是活菌載體[33]。 L. lactis 因?yàn)槠渫怀龅陌踩院宛じ侥芰Γ谡衬ひ呙绲拈_(kāi)發(fā)中具有很好的應(yīng)用前景。L.lactis可以長(zhǎng)時(shí)間定植在腸道內(nèi)，能有效將免疫原輸送到粘膜誘導(dǎo)部位，在腸道內(nèi)長(zhǎng)久存在并產(chǎn)生免疫應(yīng)答[34-5]。此外，與傳統(tǒng)的注射療法相比，這種活菌載體的生產(chǎn)更為便捷并且可以大規(guī)模生產(chǎn)[36-37]。幽門(mén)螺旋桿菌（Helicobacterpylori，HP）已被列為致癌物，會(huì)引起胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等。趙翠等[38」利用 NICE表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)了HP兩個(gè)候選抗原基因 lpp20 和cagA，利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了口服NZ3900-lpp20-ca- 對(duì) HP攻毒后具有較強(qiáng)的免疫能力。沙門(mén)氏菌（Salmonella）是致人類(lèi)食物中毒的主要病原菌，其中沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性。范真瑋等[39將鞭毛蛋白FliC 和截短的錨定蛋白PgsA'利用L.lactisNZ9000融合表達(dá)于細(xì)胞表面并對(duì)小鼠進(jìn)行口服免疫，錨定表達(dá) PgsA^′ -FliC蛋白的重組L.lactis能顯著激發(fā)特異性抗FliC 粘膜 sIgA反應(yīng)，這說(shuō)明L.lactis載體疫苗可能成為抵抗沙門(mén)氏菌感染的有效方法?？漳c彎曲菌（Campylobacter jejuni）是引起人食源性腹瀉和腸道疾病的主要原因，Gorain等40]將在不同的彎曲菌中高度保守的定植蛋白 JIpA 利用NICE 表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，將表達(dá)后的重組菌株進(jìn)行肉雞體內(nèi)評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃重組L.lactis 顯著降低了C.jejuni在盲腸內(nèi)的定植并顯著誘導(dǎo)雞粘膜 IgA免疫應(yīng)答。這說(shuō)明 L. lactis可作為抗C.jejuni定植的疫苗載體。為了開(kāi)發(fā)一種針對(duì)戊型肝炎病毒（Hepati-tis E virus，HEV）特異性免疫反應(yīng)的有效黏膜疫苗，Gao等[41|用NICE 表達(dá)系統(tǒng)對(duì)HEVORF2基因成功表達(dá)。通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了使用重組 L. lactis免疫小鼠可以有效刺激腸道、氣管和泌尿生殖道的黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生ORF2特異性IgA抗體，并產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和顯著的脾淋巴細(xì)胞增殖。劉增琪等[42]構(gòu)建了表達(dá)胸腺肽和雞 γ 干擾素融合蛋白的重組菌用于口服免疫 SPF雞，發(fā)現(xiàn)重組菌顯著提高了雞外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖活性等細(xì)胞免疫反應(yīng)，且提高了雞盲腸中有益菌的豐度。NICE表達(dá)系統(tǒng)在粘膜疫苗領(lǐng)域的研究見(jiàn)表2。

2.3在醫(yī)療領(lǐng)域的研究進(jìn)展

目前的研究表明，這些經(jīng)過(guò)改造的重組L.lactis在機(jī)體中通常具有兩種作用效果，首先是通過(guò)表達(dá)外源蛋白發(fā)揮特定的功能，其次是這些安全的菌株對(duì)機(jī)體的健康具有間接的影響。張博等[50]利用NICE 系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)人癌轉(zhuǎn)移抑制因子KISS1的分泌表達(dá)系統(tǒng)，有效抑制了人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 的遷移，并在 L ，lactis 中表達(dá)來(lái)源于植物乳桿菌的CwaA，這顯著增加了其黏附特性，提高L.lactis在體內(nèi)表達(dá)蛋白的時(shí)間，使功能蛋白的分泌量和投遞效果更具優(yōu)勢(shì)。Lee等[5i利用L.lactis對(duì)分離自藥用蘑菇的免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ8進(jìn)行表達(dá)，并評(píng)價(jià)重組L.lactis在高膽固醇飲食的動(dòng)脈粥樣硬化模型兔中的抗炎能力，結(jié)果表明，表達(dá)LZ8蛋白的重組L.lactis對(duì)高脂飲食兔非酒精性脂肪肝和動(dòng)脈粥樣硬化的形成有良好的抗炎作用。張晶等[52」構(gòu)建了表達(dá)苯丙胺酸脫氨酶（PAL）的重組L.lactis，高苯丙氨酸血癥模型大鼠口服后顯著降低了血液中苯丙氨酸濃度，有望成為治療苯丙酮尿癥的一種方法。劉東旭等[53]分別構(gòu)建了表達(dá)豬 β -防御素和PR-39抗菌肽的重組L.lactis，并將其添加至仔豬基礎(chǔ)日糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌株對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)菌均具有不同程度的抑制作用，同時(shí)顯著改善了仔豬的生長(zhǎng)性能。

3 討論和展望

NICE 表達(dá)系統(tǒng)作為應(yīng)用最廣泛的高效誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，nisin介導(dǎo)的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)將細(xì)菌的生長(zhǎng)和外源基因的高效表達(dá)分為兩個(gè)階段，相較于組成型表達(dá)系統(tǒng)更有利于外源蛋白質(zhì)的高效表達(dá)[54」。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的核心元件是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子受到特定條件的刺激啟動(dòng)功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[5-5]。研究表明加人 nisin 后，可使誘導(dǎo)的效率提高1000 倍以上，作為一種高效的表達(dá)系統(tǒng)，可以直接應(yīng)用于高水平產(chǎn)生穩(wěn)定的異源蛋白[57-58]。同時(shí)，NICE 系統(tǒng)中使用的誘導(dǎo)劑（乳鏈菌肽），宿主細(xì)菌和質(zhì)粒載體均為食品級(jí)，充分保證了生物和生態(tài)的安全，作為蛋白遞送載體能有效將目的蛋白遞送至作用部位[59]。但L.lactis 表達(dá)系統(tǒng)在應(yīng)用中也遇到一些問(wèn)題：（1）目的蛋白在菌體中表達(dá)了而無(wú)法成功分泌到胞外；（2）目的蛋白被細(xì)菌自身產(chǎn)生的一些蛋白酶降解[60-62]，Bhrugu Y等[63]構(gòu)建了表達(dá)1型痢疾志賀菌外膜蛋白A（OmpA）的 NICE 系統(tǒng)，在發(fā)酵液中檢測(cè)到目的蛋白的降解產(chǎn)物，推測(cè)目的蛋白是被菌株自身的某種蛋白酶降解，通過(guò)加入蛋白酶抑制劑降低了蛋白酶在蛋白表達(dá)過(guò)程中的影響；（3）不同外源蛋白的表達(dá)效率存在差異；（4）構(gòu)建的表面錨定表達(dá)系統(tǒng)中，小分子量蛋白易被L.lactis表面蛋白包裹，影響外源蛋白正常的功能，大分子量蛋白則存在影響表面錨定蛋白的結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，從而影響外源蛋白在 L. lactis表面的展示功能。

對(duì)于這些問(wèn)題可以深人以下研究：（1）對(duì)表達(dá)系統(tǒng)中啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)一步研究，探究其調(diào)控序列的作用機(jī)制有助于精準(zhǔn)把握對(duì) L ：lactis的定向改造；（2）探尋新型高效可控的啟動(dòng)子也是很有必要的；（3）有研究表明在L.lactis中 HtrA 蛋白是一種管家蛋白酶，參與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制，負(fù)責(zé)清除表面的異常蛋白，可以嘗試突變htrA基因提高蛋白產(chǎn)量;（4）應(yīng)用基因編輯技術(shù)對(duì)L.lactis進(jìn)行改造。

L.lactis作為乳酸菌屬中重要的模式菌株，具有很高的研究?jī)r(jià)值，并且作為一種有益的腸道微生物，L.lactis兼具食品級(jí)表達(dá)外源蛋白的功能，對(duì)它的特定改造可以滿(mǎn)足人們對(duì)于食品制造、醫(yī)療健康以及工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的需求。隨著基礎(chǔ)學(xué)科的研究不斷深人，對(duì)L.lactis的探索也會(huì)繼續(xù)深人下去，對(duì)于其食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的改造也將更有力地推進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)療和健康產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

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［責(zé)任編輯：李莉］

Abstract：Lactococcus lactis as a food-grade safe strain， is an excellent host for foreign protein expression.Based on nisin self-inducing expression mechanism，L. lactis NICE expression system is obtained and has been widely used for expression of various foreign proteins with characteristics of high induction effciency， lessself-secreted proteins，and no extracellular protease. By designing different expression elements，the exogenous proteins can be expressed intracelularly，extracellularly or on the cell surface，so as to play its role. This review introduces the construction and inducible expression mechanism of the NICE expression system， and summarizes the research status of recombinant L .lactisin the fields offood industry，medicine and health，and provides a reference for the future application of the L .lactis NICE expression system.

Key words： L. lactis；express foreign protein；nisin controlled gene expression；nisin