Expression Characteristics of Auxin Transport Carrier Genes in Yam and Their Response to N-（1-Naphthyl） phthalamic Acid

'in Dong'，Xu Shengsheng1，2，Duan Yanbi3，Cheng Yuan'，Guo Fenggen4，Wang Shiyu’，Long Wenhong （1. College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming 65O2O1， China; 2. Key Laboratory of Vegetable Biology of Yunnan Province， Kunming ， China; 3. Agricultural Teaching Experiment Center， Yunnan Agricultural University， Kunming 6502O1， China; 4. College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 6502O1， China）

AbstractIn order to investigate the effects of auxin transport carrier genes AUXs and PINs in yam （Dioscorea opposita）growth development，RT-qPCR technology was used with selected optimal reference genes to study the expression patterns of AUXs and PINs genes in different parts of vines and other tissues，as well as their response to N-（1-naphthyl） phthalamic acid（NPA）.The results showed that the stabilityof eight candidate reference gens were evaluated using Delta Ct NormFinder，geNorm and Comparative ΔCt software，and MYB gene was screened out as the reference gene to analyze the expression of auxin transport carrier genes in different parts of vines.The results of RT-qPCR analysis showed that the DoAUX2，DoAUX3，DoPINI，DoPIN3 and DoPIN7 genes showed higher expression in the upper part of young yam stems and vines than those in the lower part.The DoAUX1， DoAUX2 and DoPIN3 genes showed higher expression in the upper part of mature vines than those in the lower part.The auxin transporter carier genes were observed in shoot tips，leaves，roots，bulbil，male flowers and female flowers. Among which，the DoAUX1，DoAUX2 and DoPIN7 genes exhibited the highest expresson level in leaves，the DoAUX3 and DoPIN1 genes showed significantly higher expression in shoot tips compared to other tissues，while DoPIN3 and DoPIN6 genes showed higher expression in roots than other tisses，which showed obvious tissue specificity. Compared to the water control，NPA treatment significantly affected the expression of DoAUXI ， DoAUX2，DoAUX3，DoPIN1，DoPIN3，DoPIN6，and DoPIN7 genes，and most were down-regulated. In conclusion，the auxin transport carier genes regulated the growth and development of yam by regulating the distribution of auxin in different tissues，and NPA could affct the transport of auxin in yam plants by regulating the expression of auxin transport carrier genes.

KeyWordsAuxin transport carrier gene； Yam；Expression characteristics； Vine； N-（1-Naphthyl）phthalamic acid （NPA）

生長素（auxin）是調(diào)控植物生長發(fā)育的關(guān)鍵激素之一，其分布和運輸主要由生長素運輸載體基因（如AUX和PIN基因家族）調(diào)控。這些基因通過介導(dǎo)生長素的極性運輸，影響植物的器官形成、向性生長及環(huán)境適應(yīng)性。研究表明，生長素運輸載體基因參與甜瓜莖蔓早期的生長發(fā)育；葡萄莖蔓生長初期生長素運輸載體基因表達量較低，隨后逐漸上升，并在生長中期達到峰值，顯著促進了莖蔓的延伸發(fā)育[2]?？梢?，生長素運輸載體基因在藤蔓類植物的莖蔓發(fā)育中具有重要作用。

N-（1-奈基）鄰氨甲酰苯甲酸[N-（1-naph-thyl）phthalamicacid，NPA]是一種常用的生長素運輸抑制劑，廣泛用于研究生長素的極性運輸機制[3]。例如：NPA通過抑制草莓中生長素運輸載體基因的表達，促進了果實重量的增加[4」；在擬南芥中，高濃度NPA處理可阻斷根系的向重力性反應(yīng)，增加根表面積，從而增強根系對水分和無機鹽的吸收能力，促進植株生長[5]。這些研究為探討NPA在調(diào)控植物生長發(fā)育中的作用提供了重要參考。

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)具有特異性高、重復(fù)性強、操作簡便快捷等優(yōu)點，自1993年被正式定義以來，已成為基因表達研究的主流手段。AppliedBiosystems、Bio-Rad 等公司推出的配套儀器和試劑進一步推動了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[。RT-qPCR通過同時擴增目的基因和內(nèi)參基因，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳分析，能夠直觀地比較不同組織或材料中目的基因的表達水平[7-8]。但是基因表達量的檢測結(jié)果易受RNA模板質(zhì)量、引物特異性及反轉(zhuǎn)錄效率等因素的影響，有可能導(dǎo)致熒光定量結(jié)果與真實表達量之間存在偏差。因此，篩選合適的內(nèi)參基因是確保RT-qPCR結(jié)果準確性的關(guān)鍵步驟。

目前，關(guān)于山藥（Dioscoreaopposita）生長素運輸載體基因的研究較為有限，尤其是適合山藥莖蔓RT-qPCR分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因尚未見報道。因此，本研究首先篩選出能在山藥莖蔓中穩(wěn)定表達的用于RT-qPCR分析的內(nèi)參基因，然后系統(tǒng)分析生長素運輸載體基因在山藥不同組織和不同部位莖蔓中的表達特點及其對NPA的響應(yīng)情況，以期為未來深入探討生長素運輸載體基因在山藥生長發(fā)育中的功能提供參考。

材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

1.1.1試驗材料 供試山藥品種為云南本土品種‘牛尾’。2022年4月種植于云南省市盤龍區(qū)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山山藥實驗玻璃溫室，于山藥雄蕊發(fā)育完成前一周（7月25—31日）取莖蔓及其他組織樣品

1.1.2試驗試劑 RNAisolater Total RNA Extrac-tionReagent購于北京華越洋生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、SYBRMaster Mix（2×） 、引物、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 GoldenstarTM RT6 cDNA Syn-thesis Kit 和 2× TSINGKE Master qPCR Mix（SYBRGreenI）購自擎科生物科技有限公司；DL2000 Marker LoadingBuffer、核酸染料Green和其余藥品均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1不同部位莖蔓取樣方法取‘牛尾’山藥莖蔓上5個部位的上端組織和下端組織，用于篩選內(nèi)參基因及生長素運輸載體基因表達分析。5個部位的取樣點如下：部位1的上端組織為頂芽往下 0.5cm 長的莖蔓，下端組織為頂芽之下第1片葉往上 0.5cm 長的莖蔓，此段莖蔓顔色淺綠且直徑在 0.5～1.0mm 之間；部位2的上端組織為頂芽往下第3片葉往下 0.5cm 長的莖蔓，下端組織為頂芽往下第4片葉往上 0.5cm 長的莖蔓，此段莖蔓呈現(xiàn)翠綠色且直徑 1.1～1.7mm ;部位3的上端組織為頂芽往下第7片葉往下 0.5cm 長的莖蔓，下端組織為頂芽往下第8片葉往上 0.5cm 長的莖蔓，此段莖蔓呈現(xiàn)出綠色偏紫的顏色且直徑在 1.8～2.0mm 之間；部位4的上端組織為頂芽往下第9片葉往下 0.5cm 長的莖蔓，下端組織為頂芽往下第10片葉往上 0.5cm 長的莖蔓，此段莖蔓呈現(xiàn)出半綠半紫色且直徑 2.1～2.5mm ;部位5的上端組織為頂芽往下第11片葉往下 0.5cm 長的莖蔓，下端組織為頂芽往下第12片葉往上0.5cm 長的莖蔓，此段莖蔓顏色基本全為紫色且直徑約 2.6～3.0mm 。共計取10個不同位置的莖蔓組織，各位置重復(fù)取樣3次，稱重后分裝并用液氮速凍，保存至 -80^°C 冰箱備用。

1.2.2 其他組織取樣2022年7—8月，取‘牛尾'山藥莖尖（雄蕊生長發(fā)育完成前一到兩周取一整條莖蔓上的莖尖）葉片（取莖尖往下數(shù)第2＼～4片葉，剪掉葉柄）、根系（取成熟期和伸長期的主根根系）珠芽表皮（用小刀削取成熟珠芽的基部與頂部表皮并混合）、雄花（雄花開放一周內(nèi)取一株的雄花）及雌花（取已經(jīng)開放的雌花），保存于 -80^°C 冰箱備用

1.2.3不同濃度 NPA 處理葉片及取樣2022年10月，在盆栽山藥莖蔓發(fā)育的幼嫩期（從莖尖往下數(shù)有8～10片葉時），分別用10、20、50、100mg/L NPA噴霧處理‘牛尾’山藥從莖尖往下數(shù)第4＼～7片葉，以清水處理為對照;分別在處理后的24、48、72h 時取頂芽往下4＼～6節(jié)處的葉片，每個樣品 100mg ，重復(fù)3次，稱重后分裝并用液氮速凍，保存于 -80^°C 冰箱中備用

1.2.4適合不同部位莖蔓基因表達分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因篩選 設(shè)計8個候選基因（表1）進行莖蔓生長素運輸載體基因表達分析所需內(nèi)參基因的篩選試驗，參考文獻［10-11]的方法，分別使用DeltaCt、NormFinder和geNorm軟件比較分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，然后使用Comparative△Ct軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行綜合評價，最終篩選出適合山藥不同部位莖蔓基因表達分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因。

1.2.5山藥RNA提取、引物設(shè)計及反應(yīng)體系和程序（1）山藥總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)總RNA提取試劑盒（QuickRNAIsolationKit）說明書提取山藥不同組織的總RNA，放液氮中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉腞NA經(jīng)濃度和純度檢測合格后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA第一條鏈，用于RT-qPCR分析。

（2）引物設(shè)計及合成：從NCBI網(wǎng)站獲得山藥內(nèi)參基因篩選和表達所用的核酸序列，利用軟件Premier5.0設(shè)計內(nèi)參基因引物和生長素運輸載體基因擴增引物（表1和表2）。引物由擎科生物科技有限公司合成。

（3）山藥生長素運輸載體基因RT-qPCR反應(yīng)體系及程序：以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積為 20μL ，其中 2× T5 Fast qPCR 12μL ，模板cDNA 1μL ，上游引物0.8μL ，下游引物 0.8μL，ddH₂O5.4μL 。反應(yīng)程序： 95^°C 預(yù)變性 2～5min;95^°C 變性 10s，60～ 65^°C 退火延伸 20～50s ，循環(huán)40次。

（4）基因表達量的計算和分析方法：使用2^-ΔΔCt 法計算基因的相對表達量，然后參考趙曉進等[2的分析方法，利用SPSS23.0分析生長素運輸載體基因在不同組織、不同部位莖蔓的表達量及NPA處理后的表達量差異

注：MYB為不同部位莖蔓中生長素運輸載體基因RT-qPCR分析所用內(nèi)參基因，CKI-2為其他組織中生長素運輸載體基因RT-qPCR分析所用內(nèi)參基因， F-box 為NPA處理后山藥不同組織中生長素運輸載體基因RT-qPCR分析所用內(nèi)參基因，引物序列同文獻[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥莖蔓基因表達分析所需穩(wěn)定內(nèi)參基因 的篩選

2.1.1候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析為了篩選出適用于分析山藥不同部位莖蔓中生長素運輸載體基因表達的穩(wěn)定內(nèi)參基因，分別使用DeltaCt軟件、NormFinder軟件、geNorm軟件分析了8個候選內(nèi)參基因在山藥莖蔓中的穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示。在DeltaCt軟件中，STDEV值越小，基因表達越穩(wěn)定，可以看出，穩(wěn)定性最好的是TRX-2基因，STDEV值最小，僅1.06；其次為MYB和GAD-PH基因，STDEV值分別為1.54和1.58。在Norm-Finder軟件中，S值越小，表明基因穩(wěn)定性越好，因此，MYB基因的穩(wěn)定性最高，其S值最小，為0.504;其次為GADPH基因，S值為0.743。geNorm軟件評估內(nèi)參基因的算法與NormFinder類似，但它使用M值評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，M值越小，基因穩(wěn)定性越高，結(jié)果顯示，MYB與GADPH的M值最小，均為1.008，表明這兩個基因的穩(wěn)定性最高。綜上，MYB基因在三種軟件的評價中表現(xiàn)較好。

為避免單一軟件評價出現(xiàn)較大誤差，用Ref-Finder在線軟件對geNorm、NormFinder 和Delta Ct算法得到的結(jié)果進行綜合計算，得到8個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性綜合排名： MYBgt;GADPHgt;TRX-2gt; ACT-Igt;EF-Iαgt;F-boxgt;HISgt;α-TUB 。表明MYB基因穩(wěn)定性最高，可以用作山藥莖蔓中基因表達研究的最佳內(nèi)參基因。

2.1.2MYB作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗證 使用實時熒光定量技術(shù)進一步驗證MYB基因在山藥不同部位莖蔓中的表達穩(wěn)定性，其中Plot峰越單一內(nèi)參基因越穩(wěn)定。由圖1可以看出，MYB的Plot峰出現(xiàn)在 80～83°C ，熒光信號的變化差異較小，說明MYB基因穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)山藥莖蔓中生長素運輸載體基因的表達分析。

1代表部位1上端與下端的莖蔓；2代表部位2上端與下端的莖蔓；3代表部位3上端與下端的莖蔓；4代表部位4上端與下端的莖蔓；5代表部位5上端與下端的莖蔓。

2.2 山藥不同部位莖蔓中生長素運輸載體基因的表達分析

以MYB為內(nèi)參基因、部位1上端組織的表達量為對照，計算山藥不同部位莖蔓中生長素運輸載體基因的相對表達量，結(jié)果（表4）顯示：AUX基因家族在不同部位莖蔓均有表達，其中， DoAUXI 在部位1、部位2和部位3上端的表達量均低于下端，在部位4和部位5則呈現(xiàn)出上端表達量高于下端； DoAUX2 在部位1、部位2、部位4和部位5上端的表達量高于下端，其中部位1上下兩端的表達量差異顯著；DoAUX3在莖蔓部位1、部位2、部位3和部位5的表達量表現(xiàn)為上端高于下端，其中部位1上端的表達量顯著高于下端。三個生長素輸入載體基因中DoAUX1的表達量高，且其在莖蔓幼嫩部位（部位1、部位2和部位3）的下端組織里表達量更高。

生長素輸出載體基因中，DoPIN1基因表達量在部位1和部位2上端的表達量高于下端，在部位3和部位4上端和下端的表達量一致，在部位5下端的表達量高于上端；DoPIN3表達量在莖蔓部位1、部位2、部位4和部位5上端的表達量高于下端，尤其是部位4上端的表達量顯著高于下端；DoPIN6在部位1、部位3和部位5下端的表達量高于上端，在部位2上端的表達量高于下端，尤其是部位4上端的表達量顯著高于下端；DoPIN7基因的表達量在部位1至部位5呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，上端表達量高于下端的有部位1、部位2、部位3和部位5。

綜上所述，AUX家族和PIN家族參與了生長素在山藥莖蔓中的運輸。其中，DoAUX2、Do-AUX3、DoPIN1、DoPIN3和DoPIN7在莖蔓幼嫩部位的基因表達量高于下端；DoAUX1、DoAUX2和DoPIN3在莖蔓成熟部位的基因表達量高于下端這一表達模式表明，生長素濃度梯度的形成及其極性運輸可能依賴于這些生長素運輸載體基因的差異表達，從而影響植物的生長發(fā)育。

2.3 生長素運輸載體基因在其他組織中的表達分析

使用CKI-2作為內(nèi)參基因，以根系的表達量為對照，分析山藥生長素運輸載體基因在其他組織中的表達量。結(jié)果（表5）顯示，生長素運輸載體基因在山藥根系、葉片、莖尖、珠芽、雄花、雌花中均有表達。DoAUX1在葉片中的表達量顯著高于其他組織，在雌花中的表達量最低； DoAUX2 基因在葉片中的表達量最高，與其在根系、珠芽、雄花和雌花中的表達量具有顯著性差異； DoAUX3 在莖尖中的表達量最高，與在其他組織中的表達量有顯著性差異，在雌花中的表達量最低。在PIN家族中，DoPIN1基因在莖尖中的表達量顯著高于其他組織;DoPIN3和DoPIN6基因在根系中的表達量顯著高于其他組織，在雄花中的表達量最低；DoPIN7基因的表達量在葉片中最高，顯著高于其他組織

2.4 山藥生長素運輸載體基因表達對NPA處理的響應(yīng)

使用不同濃度的NPA處理山藥葉片，分析處理后 24、48、72h 時葉片中生長素運輸載體基因的相對表達量。結(jié)果（表6）顯示， 10～100mg/L NPA處理后 24，48hDoAUXI 基因的表達量較CK均顯著降低，而在處理后 ^72h 各處理之間沒有顯著差異。 10～100mg/L NPA處理后 24h 的DoAUX2基因表達量均顯著低于CK;48h時， Do. AUX2 的表達量隨著NPA濃度的升高而增加，其中 20mg/L 和 50mg/L NPA處理的顯著高于CK; ^72h 時，各處理間差異不顯著。DoAUX3基因的表達量在 10～100mg/L NPA處理后 24h 顯著低于CK，在 ^48h 除 20mg/L NPA處理外都顯著低于CK，在 ^72h 除 50mg/L 處理外都與CK差異不顯著。

10～100mg/L NPA處理后 24h 和 72h，DoP. IN1基因表達量與CK無顯著差異，而處理后48h ，其表達量顯著低于對照。DoPIN3基因表達量在NPA處理后 24～72h 均比CK顯著降低。DoPIN6基因表達量在使用NPA處理后的 24h 和 48h 與CK相比顯著降低; 10mg/L 和 20mg/L NPA處理后 24～72h，DoPIN7 基因表達量與CK無顯著差異，而 100mg/L NPA處理后 24～72h 其表達量均顯著低于 CK 。

綜上所述， 20，50mg/L 和 100mg/L NPA 處理后 24h 顯著抑制 AUX 基因家族的表達量；除DoPINI外，PIN基因家族的表達均受到 50mg/L 和 100mg/L NPA處理的抑制，且大多達顯著水平。

3 討論

生長素運輸載體調(diào)控植物株型形成、胚胎發(fā)育、頂端優(yōu)勢[13-14]，有助于植物體內(nèi)形成生長素濃度梯度[15]。目前，生長素輸入載體AUX基因家族和輸出載體PIN基因家族在植物特定器官高表達的報道已經(jīng)較多，例如：AUX1基因在水稻莖尖分蘗處表達較高，在葉鞘中表達量最低[16]，而AUX3基因則在莖和基部的表達量最高，在葉片中表達量最低[17]；CcAUX1在山核桃花中的表達量最高，在根系中的表達量最低，而CcAUX2在根中的表達量最高[18]；PIN2基因在桃和裂葉樺中表達量較高的部位分別是莖尖和葉片，表達量較低的部位分別是木質(zhì)部和裂片[19-20]；PIN1基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯根系中的表達量較高[21]；PIN基因家族在油棕根系中的表達量較高，而在葉片中表達量最低[22]。本研究發(fā)現(xiàn)AUX 和PIN 基因家族在山藥中也具組織表達特異性，其中Do-AUX1和DoAUX2基因在山藥葉片中的表達量最高，DoAUX3基因在莖尖中表達量最高，DoPIN3和DoPIN6基因在山藥根系中表達水平最高，而DoPIN1和DoPIN7基因分別在莖尖和葉片中表達水平最高，說明它們調(diào)控著生長素在山藥不同組織內(nèi)的運輸。

在植物莖蔓中，生長素運輸載體基因調(diào)控生長素從形態(tài)學(xué)上端運輸至形態(tài)學(xué)下端。研究表明，菜豆生長素調(diào)節(jié)基因在靠近莖尖的花和莢中的表達量高于靠近莖基部的根和莖的[23]；在葡萄和甜瓜莖蔓中， PIN 基因的表達量在莖尖中的表達量高于莖基部[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，山藥莖蔓幼嫩部分上端 DoAUX2，DoAUX3，DoPINI，DoPINI DoPIN7基因的表達量顯著高于下端，這與前人的研究結(jié)論相似，即在植物莖蔓的形態(tài)學(xué)上，生長素運輸載體基因的表達量在端部明顯高于基部。這種差異可能是影響莖蔓生長和發(fā)育的關(guān)鍵生長素運輸抑制劑NPA、三碘苯甲酸（TI-BA）、青鮮素（MH）和氯苯氧異丁酸（PCIB）常用于研究生長素運輸機理。雖然這些試劑的具體作用機理還不明確，但它們對生長素及其運輸載體基因表達量的抑制作用在很多植物中都已得到驗證[24-25]。如 NPA 抑制OsPIN9 基因的表達，影響水稻中生長素的穩(wěn)態(tài)，從而控制了水稻的生長發(fā)育[26]；TIBA可以抑制馬鈴薯中StPIN1、StPIN6及StPIN7基因的表達，進而抑制外源生長素和內(nèi)源生長素誘導(dǎo)的導(dǎo)管分化和形成[27-28]。在本試驗中，NPA處理顯著影響山藥植株中PINs基因和AUXs基因的表達，大多表現(xiàn)為下調(diào)表達，推測適宜濃度的NPA通過抑制生長素轉(zhuǎn)運載體基因的表達影響山藥體內(nèi)生長素的運輸，進而對山藥植株的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用。

4結(jié)論

山藥中生長素運輸載體基因呈現(xiàn)出組織表達特異性，表明這些基因可能在山藥不同組織的生長發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。在山藥莖蔓中，生長素運輸載體基因的表達量在形態(tài)學(xué)上端和下端存在明顯差異，這可能對山藥莖蔓的生長素運輸和伸長發(fā)育產(chǎn)生調(diào)控作用。此外，適宜濃度的NPA能夠抑制山藥中生長素運輸載體基因的表達，推測NPA處理可能通過影響生長素運輸載體基因的表達來調(diào)控山藥植株內(nèi)部的生長素運輸。本研究不僅填補了山藥中生長素運輸載體基因研究的空白，還為利用NPA調(diào)控山藥生長發(fā)育提供了新的思路，為今后進一步探索生長素運輸載體基因在山藥莖蔓發(fā)育、器官形成及環(huán)境適應(yīng)性中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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