Molecular Detection and Genetic Effect Analysis of TaDIR-B1 Gene Associated with Fusarium Crown Rot in Wheat

Zhao Qi¹ ，Guo Can2，Cheng Dungong3，Li Faji3，Li Haosheng3 （1. College of Life Sciences of Yantai University， Yantai 264006， China; 2. Shangqiu Academy of Agriculture and Forestry Sciences ， Shangqiu 4760oo， China; 3. Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center of Wheat and Maize/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetics and Breeding in Northern Huang-Huai River Plain，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Shandong Technology Inovation Center of Wheat/ Jinan Key Laboratory of Wheat Genetic Improvement， Jinan 2501OO， China）

AbstractFusarium crown rot （FCR） has become one of the most important diseases in the main wheat production region of China.Detecting the distribution of FCR resistance alelesand analyzing their genetic effcts could provide guidance and available resources for wheat FCR resistance breeding.TaDIR-Bl gene has been reported to be involved in the regulation of wheat lignin synthesis，whose los-of-function could significantly improve lignin synthesis，and then improve the resistance to FCR.In the present study，a total of 106 wheat varieties （lines） originated from home and abroad were used as materials，the disease severity was investigatd by inoculation test with FCR in field，and the distributionof diferent variants and their genetic effects on FCR were analyzed by TaDIR-Bl sequencing. The results showed that among the 1O6 materials，73 belonged to mutant type （TaDIR-B1b ）which accounting for 68.87% of the total，and 33 belonged to wild type （TaDIR-Bla）which accounting for 31.13% of the total. The mean disease severity of FCR in the materials carrying TaDIR-B1b was lower than that in the materials carrying TaDIR–BIa ，and the differences in three environments and the mean value were significant （ Plt;0.05 ）or extremely significant. The proportion of TaDIR-B1b materials in Shandong and Hebei Province was relatively higher.Jimai 17O3，Mantol，Baimangmai， Shi 4185，Boomer and Azulon carried TaDIR-Bla gene and had lower disease severity of FCR，which could be used as parents for resistant variety breeding.

KeywordsWheat; Fusarium crown rot; Genetic effect; Molecular marker

小麥?zhǔn)俏覈?guó)第三大糧食作物，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)糧食安全具有重要現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，小麥莖基腐病發(fā)病面積和嚴(yán)重度呈遞增趨勢(shì)，已成為影響我國(guó)主產(chǎn)區(qū)小麥生產(chǎn)的主要病害之_[1-4]。小麥莖基腐病是主要由假禾谷鐮刀菌（Fusariumpseudograminearum）和禾谷鐮刀菌（ F graminearum）等單獨(dú)或復(fù)合侵染引起的真菌性病害，在苗期到成株期均可發(fā)生[5-7]。苗期發(fā)病后植株葉鞘變褐或莖基部變褐腐爛，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)死苗現(xiàn)象；成株期發(fā)病后植株葉鞘和莖稈發(fā)生褐變，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)白穗現(xiàn)象[4，8-9]。在我國(guó)，小麥莖基腐病主要發(fā)生在黃淮海麥區(qū)，隨著小麥-玉米輪作和秸稈還田措施的實(shí)施，土壤中致病菌株逐年積累，加之當(dāng)前小麥主推品種的抗病性普遍較弱，以致小麥莖基腐發(fā)病程度逐年加重。2021年，省因莖基腐導(dǎo)致的“爛根”和“白穗”小麥面積超過(guò)100萬(wàn)公頃[10]；近年來(lái)，省和河北省發(fā)生莖基腐病地塊的小麥白穗率可達(dá) 20% ＼～50%^[11-12] 。培育抗病品種是應(yīng)對(duì)莖基腐病發(fā)生最經(jīng)濟(jì)有效的措施，而發(fā)掘、克隆抗病基因并進(jìn)行聚合是進(jìn)行抗病遺傳改良的重要手段之一。

目前，已克隆到的與小麥莖基腐病抗性相關(guān)的基因數(shù)目較少[13-16]。其中，Yang 等[13]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitlocus，QTL）定位分析首次發(fā)現(xiàn)了小麥莖基腐病相關(guān)基因 TaDIR-BI 。測(cè)序結(jié)果表明，TaDIR-B1在小麥抗性親本及抗性單倍型材料中第15個(gè)堿基處產(chǎn)生一個(gè)G到A的突變，形成一個(gè)終止密碼子，造成氨基酸翻譯提前終止，而在感病材料中能夠正常翻譯；通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）結(jié)合四倍體和六倍體小麥突變體庫(kù)對(duì)該基因進(jìn)行初步功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其功能缺失能顯著增強(qiáng)小麥抗莖基腐病的能力，可能通過(guò)調(diào)節(jié)植株中木質(zhì)素含量來(lái)調(diào)控植株抗病能力。

本研究以106份國(guó)內(nèi)外小麥品種（系）為材料，在接種假禾谷鐮刀菌條件下，于灌槳中后期對(duì)所有材料的莖基腐發(fā)病程度進(jìn)行鑒定，并測(cè)定材料中TaDIR-B1基因位點(diǎn)的變異類型，分析其遺傳效應(yīng)，以期為小麥抗莖基腐病的遺傳改良提供材料和指導(dǎo)。

材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用106份國(guó)內(nèi)外小麥品種（系）為試驗(yàn)材料。其中，國(guó)內(nèi)主栽品種（系）75份，農(nóng)家種18份，國(guó)外品種13份。

供試病原菌假禾谷鐮刀菌由省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。菌株擴(kuò)繁時(shí)，先將菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，然后將其接入到滅菌的小麥籽粒培養(yǎng)基中備用

1.2 田間接種及性狀調(diào)查

試驗(yàn)材料分別于2020—2021年和2021—2022年種植于市濟(jì)陽(yáng)試驗(yàn)基地（21JN和22JN）和德州市陵城試驗(yàn)基地（21DZ和22DZ）。

播種時(shí)，先將小麥籽粒擴(kuò)繁的病原菌均勻撒到開(kāi)好溝的播種行中，每行撒 40g ，然后在上面蓋一層薄土，每行均勻點(diǎn)播50粒種子。每個(gè)材料行長(zhǎng)1.5m ，行距 0.25m ，重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。田間管理參照當(dāng)?shù)卮筇锕芾?/p>

記錄每個(gè)材料的開(kāi)花期，于花后 30d （蠟熟期）從每行中隨機(jī)選取15個(gè)單莖，參照Wilder-muth等[17]和周淼平等[18]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)方法（表1）調(diào)查莖基腐病發(fā)病程度，并計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù) ε=Σε （各級(jí)病株數(shù) × 代表數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù) × 發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值） ×100 。

1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

于苗期取新鮮的小麥葉片，利用TIANGEN試劑盒提取全基因組DNA。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增 TaDIR-BI 基因序列全長(zhǎng)，PCR引物雙反轉(zhuǎn)恢復(fù)（DIR）序列參照文獻(xiàn)［13]，上游序列為 5^′ -CACCTCTCAGAGCACTTTGG-3'，下游序列為 5^′ -CCATCCCCAAGCACTAGGT- ?3^′ 。PCR反應(yīng)體系： 2× EasyTaq PCR SuperMix（ +dye） 13μL ，引物（ 10μmol/L） 各 1μL ，DNA模板（ 50～100 補(bǔ)足至 25μL 。PCR反應(yīng)程序： 95^°C 預(yù)變性 變性 50s，58^°C 退火 延伸 1.5min ，共35個(gè)循環(huán)； 72^°C 延伸 10min ，產(chǎn)物 4^°C 保存。引物合成和基因測(cè)序由青島擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 基因分型

利用Geneious（https：//www. geneious.com/）分析TaDIR-B1基因測(cè)序結(jié)果，野生型（TaDIR-Bla，第15個(gè)堿基為G）記為A，突變型（TaDIR-Blb，第15個(gè)堿基為A）記為B。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用MicrosoftExcel2021對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaDIR-B1基因的變異類型及分布

測(cè)序結(jié)果顯示，TaDIR-B1基因在106份品種（系）中有2種基因型，部分材料在第15個(gè)堿基處存在G到A的突變（圖1）。其中，野生型（ TaDIR- Bla） 材料有33份，占材料總數(shù)量的 31.13% ；突變型 TaDIR-BIb ）材料有73份，占材料總數(shù)量的68.87% （表2）。在國(guó)內(nèi)育成材料中，來(lái)源于河北和的材料在該基因位點(diǎn)多數(shù)攜帶TaDIR-B1b基因，來(lái)源于北京和山西的材料多數(shù)攜帶TaDIR-Bla基因。農(nóng)家種和國(guó)外品種中攜帶TaDIR-B1b基因的比例分別為 66.67% 和 69.23% 。

2.2 TaDIR-B1基因的遺傳效應(yīng)

將106份小麥品種（系）按照野生型和突變型進(jìn)行分組，計(jì)算兩種基因型的材料在4個(gè)環(huán)境及均值的平均病情指數(shù)（圖2）。結(jié)果表明，突變型材料在 21JN?21DZ?22JN?22DZ4 個(gè)環(huán)境及均值下的平均病情指數(shù)均低于野生型，分別降低5.4%，1.1%，6.0%，9.2% 和 5.7% 。其中，在，2020—2021年度（21JN）和 2021—2022 年度（22JN）下兩種基因型間平均病情指數(shù)差異顯著（ Plt;0.05， ），2021—2022年度在德州（22DZ）和4個(gè)環(huán)境均值下兩種基因型間平均病情指數(shù)差異極顯著（ Plt;0.01） 。攜帶TaDIR-BIb基因的材料中，濟(jì)麥1703、Mantol、白芒麥、石4185、Boomer和Azulon的莖基腐病發(fā)病程度較低，平均病情指數(shù)分別為19.89、20.67、21.22、22.45、22.56和23.22。

同一處理柱上不同小寫字母表示兩基因型間差異顯著（ Plt;0.05） ，不同大寫字母表示差異極顯著（ Plt;0.01 ）。

3討論與結(jié)論

我國(guó)黃淮冬麥區(qū)小麥莖基腐病發(fā)病較為嚴(yán)重，其中以、和河北發(fā)病最為嚴(yán)重4]此外，小麥莖基腐病為土傳病害，優(yōu)勢(shì)致病菌在不同麥區(qū)和年份間存在差異，給病害防控造成較大困難[4]。目前，莖基腐病的防控措施主要有改良耕作措施、種植多樣化作物、化學(xué)防治、選育和種植抗病品種及生物防治等[4]，其中選育和種植抗病品種是最高效、經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的措施。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)小麥品種進(jìn)行了接種鑒定，篩選得到了Sunco、蘭考198、許科718、泛麥8號(hào)、淮麥22、13等一系列中抗莖基腐病品種，但多數(shù)材料接種鑒定結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)際存在差異，在生產(chǎn)中大面積種植且抗病的品種仍然十分匱乏[19-20]。因此，繼續(xù)培育并推廣抗病品種，仍然是解決小麥莖基腐病的關(guān)鍵措施

小麥莖基腐病抗性機(jī)制十分復(fù)雜，其遺傳調(diào)控機(jī)制尚不明晰。Yang等[13研究發(fā)現(xiàn)，TaDIR-B1的功能缺失可顯著提升小麥植株木質(zhì)素含量和抗氧化酶活性，進(jìn)而顯著增強(qiáng)對(duì)莖基腐病的抗性。本研究表明，攜帶TaDIR-BIb基因材料的平均莖基腐病發(fā)病程度低于攜帶 TaDIR-BIa 基因的材料，說(shuō)明TaDIR-B1b基因可在一定程度上提升小麥莖基腐病抗性。本研究選用的106份材料中，攜帶TaDIR-BIb基因的材料數(shù)目約為攜帶Ta-DIR-BIa 基因材料數(shù)目的2倍，且來(lái)源于和河北的材料中攜帶TaDIR-BIb基因比例較高，說(shuō)明和河北的品種中 TaDIR-BIb 位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異比例較高，可為下一步育種工作提供參考。

目前，生產(chǎn)中抗莖基腐病小麥品種嚴(yán)重匱乏，絕大部分品種表現(xiàn)為中感或高感莖基腐病。由于小麥莖基腐病是由多基因控制的數(shù)量性狀，利用分子標(biāo)記聚合抗病基因并導(dǎo)入新品種中，是培育抗病品種的重要策略之一[21-22]。本研究表明，攜帶 TaDIR-BIb 基因可使材料的病情指數(shù)降低1.1%～9.2% ，降低幅度有限，尚不能滿足育種需求。因此，需要繼續(xù)挖掘并克隆新的莖基腐病抗性基因，利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合多個(gè)微效抗病基因，進(jìn)而提升抗病性、培育抗病小麥品種。本研究中，濟(jì)麥1703、Mantol、白芒麥、石4185、Boomer和Azulon攜帶TaDIR-Blb基因，且莖基腐病病情指數(shù)較低，可作為親本結(jié)合當(dāng)?shù)貎?yōu)異品種，配制組合選育抗莖基腐病且高產(chǎn)的小麥新品種。

參考文獻(xiàn)：

[1]MaJ，DuGY，LiXH，etal.Amajorlocuscontrollingmalondi-aldehydecontentunderwaterstressisassociatedwithFusariumcrownrotresistance in wheatJ].MolecularGeneticsandGe-nomics，2015，290：1955-1962.

[2]YangX，Pan Y B，Singh PK，et al. Investigation and genome-wide association study for Fusarium crown rot resistance in Chi-nese commonwheat[J].BMCPlantBiology，2019，19：153.

[3] 胡海燕，董清峰，李冬梅，等.省小麥莖基腐病調(diào)查及優(yōu)勢(shì)病原分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2021，35（8）：1802-1808.

[4] 欒冬冬，賈吉玉，王光州，等.中國(guó)小麥莖基腐病的發(fā)生現(xiàn)狀及防治策略[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2022，42（4）：512-520.

[5] 張磊磊，閆香凝，原敏婕，等.小麥種質(zhì)資源莖基腐病抗性鑒定及定位分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2024，25（2）：1-12.

[6] 李怡文，李桂香，黃中喬，等.假禾谷鐮孢引起的小麥莖基腐病發(fā)生危害與防控研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2022，24（5）：949-961.

[7] 李佩玲，王同偉，朱軍生，等.近年省小麥莖基腐病發(fā)生特點(diǎn)及原因分析[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2022，42（7）：44-45，81.

[8］朱運(yùn)啟，靳鵬飛，王峭，等.陜西省小麥莖基腐病病原菌鑒定及其致病力分析[J]．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2022，49（3）：824-831.

［9］陳一品.黃淮海小麥主產(chǎn)區(qū)莖基腐病發(fā)生及綜合防控措施[J].基層農(nóng)技推廣，2020，8（11）：76-77.

［10］趙利民，呂國(guó)強(qiáng)，何洋，等.省小麥莖基腐病發(fā)生現(xiàn)狀及綜合防控措施[J]．中國(guó)植保導(dǎo)刊，2022，42（5）：49-51.

[11］紀(jì)莉景，栗秋生，王連生，等.河北省小麥冠腐病發(fā)生現(xiàn)狀及病原菌初探[J].植物保護(hù)，2016，42（5）：154-157.

[12]郭燦，程敦公，齊軍山，等.普通小麥苗期莖基腐病抗性QTL 定位[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，54（7）：1-7.

[13] Yang X，Zhong S B，Zhang Q J，et al. A loss-of-function of thedirigent gene TaDIR-B1 improves resistance to Fusarium crownrot in wheat[J].Plant Biotechnology Journal.2O21，19：866-868.

[14]Lv G G，Zhang Y X，Ma L，et al. A cell wallinvertase modu-lates resistance to fusarium crown rot and sharp eyespot in com-mon wheat[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2023，65（7） ：1814-1825.

[15]Qi HJ，Zhu XL，Shen WB，et al. TaRLK-6A promotes Fusari-um crown rot resistance in wheat[J]. Journal of IntegrativePlant Biology，2024，6（1） ：12-16.

[16]Xiong F，Zhu XL，Luo C S，et al. The cytosolic Acetoacetyl-CoA thiolase TaAACT1 is required for defense against Fusariumpseudograminearum in wheat[J]. International Journal of Mo-lecular Sciences，2023，24（7） ：6165.

[17]Wildermuth G B，McNamara R B. Testing wheat seedlings forresistance to crown rotcaused by Fusarium graminearum group1[J].Plant Disease，1994，78（10） ：949-953.

[18］周淼平，姚金保，張鵬，等.小麥抗莖腐病種質(zhì)篩選及鑒定新方法的建立[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17（2）：377-382.

［19］楊云，賀小倫，胡艷峰，等.黃淮麥區(qū)主推小麥品種對(duì)假禾谷鐮刀菌所致莖基腐病的抗性［J].麥類作物學(xué)報(bào)，2015，35（3） ：339-345.

［20］蒲樂(lè)凡，任慧，歐楊晨，等.小麥莖基腐病和赤霉病抗源篩選及關(guān)聯(lián) SNP位點(diǎn)分析[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2020，40（7）：780-788.

［21］何中虎，夏先春，陳新民，等.中國(guó)小麥育種進(jìn)展與展望［J].作物學(xué)報(bào)，2011，37（2）：202-215.

[22］白斌，杜久元，何瑞，等.成株抗性與全生育期抗性基因聚合培育抗條銹性小麥新品種[J]．植物保護(hù)，2023，49（6）：47-54.