Genome-Wide Identification of ANT Gene Family in Quinoa （Chenopodium quinoa Willd.） and Their Expression Analysis in Callus Tissues

Gao Aihong1， Zhang Xia1，Cao Meng1，An Kexin'， Yin Haibo1，Guo Shanli ^1，2 ， Zhang Ping3， Zhao Bo3

（1. School of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264OO5，China;2. College of Grassland Sciences ， Qingdao Agricultural University， Qingdao 2661O9， Cihna;3. Zhongli Salt Field Quinoa （Dongying） Seed Technology Co.， Ltd.， Dongying 257345， China）

Abstract ANT/euANT（AINTEGUMENTA） is a class of APETALA2（AP2） type transcription factor thatonly exists inthe plant and belongs to the AP2/EREBP family.Inthis study，the identification and bioinformatics analysis of quinoa ANT gene family were carried out utilizing the genome database of quinoa，and their expression in diffrent callus tissues and buds were analyzed through qRT-PCR experiment. The results indicated that a total of 13 members of the ANT gene family with two AP2 conserved domains were identified， which unevenly distributed on 9 chromosomes of quinoa and were named as CqANT1 to CqANT13 based on their positions on the chromosomes.The CqANT1 to CqANT13 proteins had the amino acid length ranging from 244 to 710 aa， the molecular weight from 27.20 to 77.22kDa ， and the isoelectric point from 5.57 to 9.21，so they were clasified as unstable hydrophilic proteins localized in nucleus.Gene collinearity analysis revealed that 12 CqANT genes formed 6 pairs of segmental duplications，but no tandem duplication events were identified.The analysis of promoter cis-acting elements found that the promoter regions of quinoa ANT family members contained various elements response to hormones and environmental factors，suggesting their involvement in regulating quinoa's responses to abiotic streses and hormone signaling cascades. They had high homology with that of the dicotyledonous plant Arabidopsis.Expression analysis showed that the expression of he ANT genes i quinoa were tissue-specific and had a certain response to abiotic stresss.The expression of the quinoa ANT genes were present in both bud and diferent callus tissues，indicating that the quinoa ANT genes played important roles in induction and maintenance of buds and calls tissues.The results of this study could provide a basis for further revealing the function and regulatory mechanism of quinoa ANT genes in the future.

KeywordsQuinoa（Chenopodium quinoa））；ANT gene family； Bioinformatics analysis； Expression incallus tissue

具有調控再生能力的基因有很多，其中ANT轉錄因子是調節(jié)植物生長發(fā)育的主要轉錄因子之一。ANT轉錄因子屬于AP2亞家族中euANT（AINTEGUMENTA/AINTEGUMENTA-like）亞組，不僅參與抵抗脅迫反應，還參與調控植物的生長發(fā)育進程。根據蛋白質中AP2結構域的相似性，將AP2超家族劃分為4個亞家族：ERF、AP2、RAV 和 Soloist[1-2]。AP2 亞家族包含兩個保守AP2結構域[3]，并進一步劃分為euAP2組和ANT組，主要參與植物器官生長發(fā)育調控[4]，其中ANT組主要包括euANT亞組和basalANT（WRIN-KLED-like）亞組，不具有miR172識別位點，并通過特定的氨基酸特征來區(qū)分［2]

1996年在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中首次發(fā)現ANT基因與胚珠發(fā)育有密切聯系[4]ANT基因主要調控花器官的生長發(fā)育，參與花形態(tài)大小和胚珠發(fā)育等過程的調控[5]，過表達大白菜BrANT基因可促進細胞增殖，使氣孔數量增加，從而減緩葉片衰老[6]。擬南芥euANT亞組中的ANT基因也能促進芽的發(fā)生[7]。在水稻中過量表達谷子SiANT1基因會促進水稻單株分數、籽粒重以及莖葉和側根器官的增多，提高水稻對鹽脅迫的耐受性[8]?？傊?，ANT基因對植物器官的生長發(fā)育有很大的影響。

藜麥是雙子葉一年生植物，富含人體所需要的維生素、礦質營養(yǎng)、膳食纖維、脂質和蛋白質等營養(yǎng)物質9，且生物多樣性豐富，具有耐旱、耐寒、耐鹽堿性、耐瘠薄等優(yōu)良的生物學特性。我國關于藜麥的研究主要包括栽培、遺傳育種、化學因子、抗寒抗旱抗病蟲能力、產品開發(fā)等方面[0]，但目前我國藜麥的育種工作仍處于探索階段，雜交育種很難進行，基因功能的驗證和傳統育種的探索也受到一定限制[1]。利用現存的藜麥組織再生體系培養(yǎng)無毒苗，在提升無性繁殖能力的同時大大縮短了育種時間[12]。但在分子育種方面，藜麥的遺傳轉化仍處于探索階段，很少涉及轉基因技術。前人嘗試以目前已經成功建立的藜麥離體再生體系[12-14]為基礎，將具有調控生長能力的基因轉入藜麥中，以完善遺傳轉化體系，進一步提升藜麥的育種能力。而能夠影響植物器官生長發(fā)育的ANT基因在藜麥中的功能驗證等方面的研究仍欠缺。

本研究對藜麥ANT基因家族進行鑒定，并基于生物信息學方法對其核苷酸和氨基酸序列進行分析，利用轉錄組數據分析在不同組織和不同脅迫下的表達，以及驗證其在藜麥芽與不同愈傷組織材料中的表達情況，以期為揭示藜麥ANT基因的功能和調控機制奠定一定理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料及處理

藜麥品種077種子由煙臺大學植物發(fā)育和遺傳育種實驗室保存，并誘導產生胚軸愈傷組織、子葉愈傷組織、繼代培養(yǎng)愈傷組織和芽發(fā)生4個狀態(tài)的植物材料。

1.2 藜麥ANT基因的生物信息學分析

本研究基于生物信息學方法，對藜麥的全基因組數據進行篩選，確定候選ANT家族成員，并進行相關分析：通過NCBI網站的CDD工具對藜麥ANT候選基因進一步鑒定，利用Expasy網站分析蛋白理化性質，利用Plant-mPLoc在線工具預測亞細胞定位，用TBtools軟件繪制染色體位置分布，用GSDS2.0在線工具確定獨特結構、MEME在線工具預測保守基序，用TBtools工具對藜麥ANT基因進行物種內的共線性分析，確定藜麥ANT基因組位置與基因復制事件和基因表達等

1.3 藜麥愈傷組織的培養(yǎng)

選擇飽滿藜麥種子，經多重消毒后點播于生根基礎培養(yǎng)基中，暗處理 4d 后光下培養(yǎng) 3d ，切取無菌苗子葉下 1cm 處的胚軸段和帶 0.5cm 莖的子葉，分別在含 0.5mg/L2，4-D 和 0.5mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng) 25～30d ，誘導出子葉愈傷組織和胚軸愈傷組織材料，再經過增殖培養(yǎng)基（ MS+0.1mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA） 培養(yǎng)20～25d 獲得繼代培養(yǎng)愈傷組織材料。切下無菌苗帶有 1cm 莖的子葉，使用含 1.0mg/L6-BA 的2×MS 培養(yǎng)基培養(yǎng) 20～25d 獲得芽發(fā)生材料。

1.4 藜麥組織材料中ANT基因的qRT-PCR檢測

收集藜麥愈傷組織材料（子葉愈傷組織、胚軸愈傷組織、繼代愈傷組織）以及芽發(fā)生材料，使用TransZol試劑盒按照說明書提取總RNA。使用 TransScript？ Reverse Transcriptase 反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）合成cDNA。參照 TransStart？ Top Green qPCR SuperMix 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）說明書配制反應體系，對藜麥ANT基因（表1）進行qRT-PCR檢測，每組3次重復。采用 2^-ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達量，并使用MicrosoftExcel和Prism軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 藜麥ANT家族成員的鑒定和蛋白理化性質分析

對藜麥ANT基因家族進行鑒定，最終得到13個藜麥ANT基因，根據它們在染色體上的位置，命名為CqANTI—CqANT13。CqANTs基因及其編碼蛋白的基本信息如表2所示。CqANTs蛋白的氨基酸長度為 ，分子量介于 27.20～ 77.22kDa 之間，其中CqANT1最小，CqANT11最大;等電點在 5.57～9.21 之間，CqANT5 最低，CqANT8最高；不穩(wěn)定系數在 32.69～66.98 之間，除CqANT1外12個蛋白的不穩(wěn)定系數均大于40，預測為不穩(wěn)定蛋白；親水系數都小于0，為親水蛋白；蛋白亞細胞定位結果顯示均定位于細胞核。

2.2 藜麥ANT基因家族系統進化分析

為進一步探究藜麥ANT基因家族的進化關系和功能，對藜麥、擬南芥、水稻、山核桃的ANT蛋白序列進行多序列比對，并利用藜麥的13個、擬南芥的8個、水稻的10個、美洲山核桃的12個ANT序列構建系統發(fā)育進化樹。結果（圖1）表明，43個ANT 家族成員被分為Groupl—Group4四組，其中Group1 和Group3包含的藜麥 ANT家族成員最多，均為4個；Group2次之，含有3個；Group4 最少，僅含有2個。在Group1中，CqANT3與CqANT9的同源性高，且與 0s03g56050.1 、Os07g03250.1具有較高的同源性；CqANT6與CqANT8 同源性較高。在Group2 中，CqANT1、CqANT2同源性較高，同時與 0s03g07940.1 具有較高的同源性;CqANT13與OF32974-RA同源性較高。在Group3中，（CqANT5、CqANT10）、（CqANT7、CqANT12）分別與兩個OFANTs和兩個AtANTs同源性較高。在Group4 中，CqANT4、CqANT11與OF13068-RA、OF18987-RA的同源性較高。藜麥和美洲山核桃、擬南芥ANT家族成員大多分布在一起，表明它們與雙子葉植物的親緣關系較近。

圖1藜麥及其他物種ANT基因家族蛋白序列系統進化樹

2.3藜麥ANT基因家族成員的共線性分析

在共線性分析中，同一染色體上距離小于200kb 的密切相關基因被定義為串聯重復，否則被定義為片段重復[15]。對藜麥ANT基因家族的共線性分析結果（圖2）顯示，13個CqANTs基因分布在9條染色體上，分別是ChrO1、ChrO2、Chr03、Chr05、Chr09、Chr10、Chr12、Chr15、Chr18;有6對共線性基因參與了片段重復，分別為CqANT1/CqANT2、 CqANT3/CqANT9、 CqANT4/CqANT11、CqANT5/CqANT10、CqANT6/CqANT8、CqANT7/CqANT12，不存在串聯重復。此外，利用藜麥的ANT基因對信息計算了這6對共線性基因的非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks）以及兩者之間的比值（ Ka/Ks^′ ），并進行選擇壓力分析，結果（表3）表明，這6對共線性基因的 Ka/Ks 值均小于1，為 0.083 584 951～0.246 423 563 ，說明ANT基因主要受到純化選擇作用。

2.4藜麥ANT基因家族成員的基因結構和蛋白保守基序分析

通過MEME在線工具在藜麥ANT基因家族成員中鑒定10個保守基序（圖3A），這些保守基序在各成員中分布不均勻，其中，Motif2、Motif3、Motif 4、Motif5Motif7Motif8Motif9和Motif10并不存在于所有蛋白序列中，推測這8種基序可能決定了不同的生物學功能;Motif1和Motif6存在于所有CqA-NTs蛋白中;Motif2和Motif7存在于除CqANT11外的所有蛋白中；Motif4存在于除CqANT8外的所有蛋白中;CqANT1、CqANT2、CqANT5 和 CqANT11 中不存在 Motif 3;CqANT1、CqANT2、CqANT4、CqANT11中不存在 Motif 5;CqANT3、CqANT9、CqANT13中不存在Motif 9;Motif10 只存在于CqANT7、CqANT12中。說明不同的CqANT蛋白含有不同的Motif，CqANT1和CqANT2的Motif相似度最高，兩者均不含有Motif3、Motif5、Motif8、Motif10;CqANT3和CqANT9、CqANT7和CqANT12的Motif相似度較高;CqANT家族成員的同源性越高，其蛋白Motif的組成和分布越相似，推測在藜麥生長發(fā)育過程中可能具有相似的調控作用。

利用NCBI網站上CDSearch分析ANT蛋白的保守結構域，發(fā)現該蛋白具有AP2和少部分AP2超家族的保守結構域，符合ANT蛋白家族的典型結構特征（圖3B）。通過系統進化樹可以將藜麥ANT家族的每個基因進行對比，其基因結構大致相似;對藜麥ANT基因的外顯子（exon）、非翻譯區(qū)（untranslatedregion，UTR）、內含子（in-tron）組成進行分析，結果（圖3C）表明，各基因間內含子、外顯子的數量不等，編碼序列（coding se-quence，CDS）外顯子數量均在4個以上。

圖3藜麥ANT基因家族成員保守基序（A）、保守結構域（B）和外顯子/內含子結構分析（C）

2.5 藜麥ANT基因家族的啟動子順式作用元件分析

為進一步了解藜麥ANT基因家族成員的生物學功能和基因表達能力，對CqANTs基因上游2000bp 序列進行分析，結果（圖4）發(fā)現，從13個CqANTs基因的啟動子區(qū)域共鑒定到光響應、脫落酸響應、赤霉素響應、壓力與防御響應、分生組織表達、柵欄葉肉細胞分化、胚乳及低溫干旱響應等15種相關的順式作用元件，推測CqANTs基因可能參與調控藜麥非生物脅迫、植物生長發(fā)育相關響應和激素調控相關的響應等。其中，數量最多的順式作用元件為光響應元件，一共有184 個，CqANT7中最多，其次為CqANT11 和CqANT13。第二類是參與激素調節(jié)的相關響應元件，脫落酸響應元件最多，其中CqANT2、CqANT3和CqANT1I較多，生長素響應元件僅存在于CqANT9、CqANT11、CqANT12和CqANT13中，表明這些基因可能參與脫落酸與生長素信號調控網絡。第三類是植物生長發(fā)育相關響應元件，包括厭氧誘導、胚乳表達、分生組織表達、種子特異性調控和柵欄葉肉細胞分化，其中僅CqANT1、CqANT6、CqANT7 和CqANT8、CqANT11、CqANT12具有胚乳表達元件，CqANT3、CqANT6、CqANT8和CqANT9具有柵欄葉肉細胞分化元件，CqANT3和CqANT9具有分生組織表達元件，CqANT4和CqANT8啟動子區(qū)域具有種子特異性調控元件，表明這些基因可能對植物生長發(fā)育有一定影響。第四類是逆境應答相關元件，包括創(chuàng)傷、防御、低溫和干旱等響應元件，其中CqANT8和CqANT13具有較多的防御與壓力反應元件，CqANT3啟動子區(qū)具有較多的低溫響應元件，CqANT9啟動子區(qū)域具有較多干旱響應元件

2.6 藜麥ANT基因家族的表達模式分析

為探究藜麥ANT基因家族的組織表達特異性，對頂端分生組織、種子、莖、葉、花和果實等13個部位的轉錄組數據進行分析，結果（圖5A）顯示，ANT基因家族少部分基因在花和未成熟種子、葉柄、幼苗、葉、白甜藜麥花和黃苦藜麥花中有偏低量的表達，大部分基因在頂端分生組織、莖、節(jié)間莖、花序、干種子、白甜藜麥果實和黃苦藜麥果實中表達量較高。其中CqANT3、CqANT6、CqANT8在頂端分生組織中表達量較高，CqANT9在莖中表達量較高，CqANT6、CqANT8、CqANT13在花序中表達量較高，CqANT2、CqANT5、CqANT7、CqANT1O、CqANT11、CqANT12、CqANT13在干種子中表達 量 較 高，CqANT1、CqANT2、CqANT4、CqANT5、CqANT7、CqANT1O、CqANT11、CqANT12在白甜藜麥果實中表達量較高。

根據現有的藜麥轉錄組數據，對不同非生物脅迫下的CqANTs基因表達模式進行分析，結果（圖5B）發(fā)現，在地上部分，低濃度磷酸鹽脅迫（HLPS）和鹽脅迫（HSS）僅對CqANT13有較強誘導。但在地下部分，CqANTs基因表達量大多都較高，其中，在HLPS下，CqANTI、CqANT2、CqANT7有明顯響應；在干旱脅迫下，CqANTI2的響應較為明顯;在高溫脅迫下，CqANT4、CqANT5、CqANT11有明顯響應;在鹽脅迫下，CqANT6、CqANT8的表達量上調顯著。綜合來看，在非生物脅迫處理的水培苗中，CqANTs基因在地下部分的表達量比地上部分的高。

2.7 藜麥愈傷組織培養(yǎng)及CqANTs基因表達分析

無菌培養(yǎng)藜麥幼苗，切取幼苗的不同部位以獲得不同類型的外植體（圖6）。為收集不同的愈傷組織與芽發(fā)生材料，將外植體在不同激素配比的培養(yǎng)基（誘導愈傷組織： MS+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L6-BA ;誘導芽： ?2×MS+1.0mg/L6-BA） 培養(yǎng) 20～25d 后，誘導出愈傷組織并增殖培養(yǎng)或者發(fā)生芽（圖7），選擇生長狀態(tài)良好的子葉愈傷組織、胚軸愈傷組織、繼代愈傷組織、芽發(fā)生材料，以備RNA的提取A、B：無菌苗；C：子葉外植體；D：胚軸外植體；E：芽發(fā)生材料。

利用qRT-PCR檢測CqANTs基因在藜麥組織培養(yǎng)中的表達情況，結果（圖8）顯示，大部分CqANT基因在藜麥不同愈傷組織和發(fā)生芽中具有一定的表達，如CqANT1、CqANT3、CqANT7和CqANT11這4個基因在子葉和胚軸的愈傷組織中表達都相對較高，其中CqANT7表達量最高且較其他組織幅度較大;CqANT3、CqANT8在繼代培養(yǎng)的愈傷組織中表達量較高；而CqANT13僅在發(fā)生芽中表達量較高，在其他3個狀態(tài)的愈傷組織中表達較弱。

3討論與結論

本研究采用生物信息學方法，基于藜麥全基因組數據，共鑒定出13個CqANT基因，分布在1、2、3、5、9、10、12、15號和18號染色體上。不同物種中發(fā)現ANT基因家族成員的數量不同，其染色體分布也不均勻，如擬南芥中含有8個ANT基因[16]，分布在1、3、4、5號染色體上[4]；水稻中含有10個PLT（Plethora/ANT）基因成員[17-18]，分布在2、3、4、6、8、11號染色體上[4]；美洲山核桃中含有12個ANT基因成員[19]，分布在1、6、8、13、14號染色體上[20]。根據物種間的親緣關系，對3種雙子葉植物（藜麥、擬南芥和美洲山核桃）和一種單子葉植物（水稻）進行系統發(fā)育分析，藜麥ANT基因與雙子葉植物擬南芥和美洲山核桃的ANT同源性更高一些，推測其可能有相似特性，對植物生長發(fā)育起重要作用。

基因共線性分析發(fā)現有6對片段復制，無串聯復制，每個基因對都有相似的基因結構和緊密的進化聯系， Ka/Ks 的值都小于1，說明藜麥ANT家族在進化過程中受到純化選擇壓力[21]。對CqANTs基因啟動子上游 2 000bp 序列進行預測，發(fā)現光響應元件占啟動子順式作用元件的主要部分；其次是激素調控相關的響應元件，如脫落酸響應元件，其數量多達26個，赤霉素響應元件有13個，生長素響應元件有4個。對水稻PLT基因的研究發(fā)現，該基因均受脫落酸（ABA）調控且呈現上調趨勢[18]。推測藜麥ANT基因也受光和脫落酸激素的調控，通過影響細胞生長和增殖來調節(jié)植物器官的發(fā)育。此外，啟動子順時作用元件預測CqANT3具有較多的低溫響應元件，CqANT9具有較多干旱響應元件，表明CqANT基因參與不同非生物脅迫的應答

對藜麥ANT基因的表達分析得出，大部分CpANT基因在頂端分生組織、莖、節(jié)間莖、花序、干種子、白甜藜麥果實和黃苦藜麥果實中表達量較高，如CqANT6、CqANT8對頂端分生組織調控更明顯，而CqANT13在花序中表達量較高；此外，在地上部分，僅CqANT13對低濃度磷酸鹽脅迫和鹽脅迫有較強的響應，而在地下部分（根），各種脅迫下ANT表達量大多明顯上調，推測CqANTs基因在藜麥的頂端分生組織、莖和種子等器官生長發(fā)育以及對抗脅迫的過程中有重要作用。藜麥ANT家族基因在發(fā)生芽以及不同愈傷組織中均有一定的表達，這說明藜麥ANT基因不僅對芽的生長發(fā)育有影響，在愈傷組織誘導和維持中也發(fā)揮著重要作用。

綜上，本研究對藜麥ANT基因家族進行了生物信息學的系統分析，并分析了其表達模式，結果可為研究藜麥ANT轉錄因子家族的功能及建立藜麥再生及遺傳轉化體系奠定基礎。

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