植物內(nèi)生真菌是指全部或者部分生命周期發(fā)生在宿主植物體內(nèi)，不會引起任何明顯疾病病癥的微生物1，在長期協(xié)同發(fā)展進化過程中，內(nèi)生真菌與植物形成互惠共利的關(guān)系[2]。一方面，宿主植物能夠提供內(nèi)生真菌生長繁殖所必需的微環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]。另一方面，內(nèi)生真菌可通過產(chǎn)生吲哚乙酸（indole-3-aceticacid，IAA）和減少乙烯合成促進植物種子萌發(fā)及根、莖、葉的生長[5]，同時也能通過調(diào)節(jié)活性氧協(xié)助植物抵抗逆境脅迫[]；此外，內(nèi)生真菌通過真菌誘導子刺激植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成，并在植物代謝過程中將某些關(guān)鍵基因垂直傳遞給內(nèi)生真菌，導致真菌產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物[6-7]。因此，了解植物內(nèi)生真菌多樣性不但對于研究宿主植物一微生物互作關(guān)系具有重要意義，而且對其開發(fā)利用也具有重要價值。

管花秦蘇（Gentiana siphonantha Maxim.）隸屬于龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（GentianaL.）秦蘇組（Sect.CruciataGaudin）的一種多年生草本植物[8]，主要分布在青藏高原及周邊地區(qū)，以根人藥，是重要的中藏藥材[9]。其主要含龍膽苦昔，在抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等方面具有重要作用[10-12]。高寒草甸是青藏高原最主要的草地類型，約占青藏高原草地面積的 46.7%^[13] ，因海拔高、氣候寒冷干旱、生長季溫度低、太陽輻射強度大等環(huán)境特點，植被遭受到較強的選擇壓力[14]。在長期的生物進化過程中，高寒植物通過形成獨特的調(diào)節(jié)機制、適應高原生境的形態(tài)和生理特性以應對寒冷和干旱脅迫[15-16]。研究表明，植物對脅迫的耐受性與其相關(guān)微生物有關(guān)[17]，與根際細菌的相互作用相比，寄主植物與內(nèi)生菌的相互作用可直接影響植物特性[18]。

近年來，對秦蘇組植物的研究主要集中在藥理活性與質(zhì)量標準[8]、近緣種進化關(guān)系[19]物種分布與生境之間關(guān)系[20]以及網(wǎng)絡藥理和分子動力學[21]等方面，而對管花秦蘇內(nèi)生真菌及其與植物之間互作關(guān)系卻鮮有研究。管花秦作為典型的高寒草甸植物可能與其內(nèi)生真菌形成了某種互作機制以適應寒冷干旱生境，因此了解管花秦芃內(nèi)生真菌組成將有助于更好地解釋管花秦芃的高原生態(tài)適應機制。

本研究采用植物組織塊法分離開花期、生長于高寒草甸土壤中管花秦芃內(nèi)生真菌，運用形態(tài)學和ITS序列進行內(nèi)生真菌種屬鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探討管花秦蘇可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性，為下一步研究管花秦芃內(nèi)生真菌與宿主植物的關(guān)系和篩選具有活性的菌株提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

于2023年8月，在青海省海北藏族自治州門源回族自治縣（東經(jīng) 100^°99^′ ，北緯 37^°91^′ ，海拔3 435m 采集盛花期的整株野生管花秦蘇，并采集根系土壤，共采集樣本10份。樣品采集后低溫保存并帶回實驗室處理，經(jīng)藥學院林鵬程教授鑒定為野生管花秦芃。

1.2方法

1.2.1植物組織表面消毒將樣品用流水沖洗干凈，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒處理：用 75% 乙醇浸泡 3min ，無菌水沖洗 次， 8% NaClO溶液中浸泡 3～5min ，無菌水沖洗 3～5 次，用無菌濾紙吸干組織表面殘留的水分。

1.2.2內(nèi)生真菌的分離純化將消毒完成的植物切成 0.5cm×0.5cm 組織塊，并接種至PDA培養(yǎng)基上。采用組織印跡法作為對照處理，觀察消毒是否完全。 28°C 恒溫培養(yǎng) 7～10d^[22] 后，用接種針挑取菌絲至新的PDA培養(yǎng)基上進行真菌純化，直至獲得單一菌株。

1.2.3內(nèi)生真菌鑒定形態(tài)學鑒定：觀察并記錄PDA平血中菌落的直徑、顏色、形態(tài)，用乳酸酚棉蘭染液將菌絲體染色后觀察菌絲體及孢子形態(tài)對照《真菌鑒定手冊》23進行形態(tài)鑒定。分子生物學鑒定：采用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取真菌DNA，采用真菌通用引物ITS1（ 5^′ -TC-CGATGGTGAACCTGCGG- ?3^′ ）和ITS4（ 5^′ -TC-CTCCGCTTATTGATATGC- 3^′ ）進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用 10g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將測序所得ITS序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，使用MEGA11軟件采用鄰接法（neighbor-joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。kimura 2-parametermodel計算進化距離，1000次重復檢驗發(fā)育樹的可靠性。用i-TOL軟件美化進化樹。

1.2.5 多樣性分析 在MEGA11軟件中，將所得序列前后嵌合堿基刪除，使每個序列長度約為520bp 。運用Mothur程序?qū)⒐灿行蛄邢嗨贫却笥?97% 的同一序列劃分為同一個OTU，采用 Ex^- cel2010整理統(tǒng)計內(nèi)生真菌定殖及種屬分類數(shù)據(jù)?；贠TUs豐度表，通過圖圖云平臺（www.cloudtutu.com）進行 α 多樣性、主坐標（PCoA）分析及非度量多維尺度（NMDS）分析。

1.3 統(tǒng)計方法

內(nèi)生真菌定殖率、分離率、相對頻率、多樣性指數(shù)等指標主要反映內(nèi)生真菌在管花秦蘇不同組織部位的分布情況。

定殖率（colonizationfrequrncy，CF）和分離率（isolationfrequrncy，IF）可衡量組織中內(nèi)生真菌豐富程度及受多重侵染發(fā)生頻率。相對頻率（relativefrequently，RF）主要反映樣本內(nèi)生真菌群落中某種內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度。

定殖率 內(nèi)生真菌定殖的組織塊數(shù)/全部組織塊數(shù) ×100%

分離率 某一類群內(nèi)生真菌菌株/分離樣品組織總塊數(shù) ×100%

相對頻率 某種真菌菌株數(shù)/分離所得總菌株數(shù) ×100%

α 多樣性分析主要反映單個條件下群落的物種豐富度和多樣性，主要包括Richness指數(shù)（D_R ，物種豐富度）、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H^′ ，物種多樣性，主要針對優(yōu)勢種）、Gini-Simpson多樣性指數(shù) （1-D ，物種多樣性指數(shù)，主要針對稀有種）、Pielou均勻度指數(shù)（E，物種分布均勻程度）、Invsimpson 指數(shù)（ D_Invsimpson ，生態(tài)優(yōu)勢度）、Chaol指數(shù)（ S_Chaol ，豐富度估計量）、ACE指數(shù)（ S_ACE ，基因豐富度）和goods_coverage指數(shù)（C，反映了測序深度），具體計算公式如下：

Richness指數(shù)：

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：

Gini-Simpson多樣性指數(shù)：

Pielou均勻度指數(shù)：

Invsimpson指數(shù)：

Chaol指數(shù)： ACE指數(shù)： goods_coverage指數(shù)：

P_i 表示第 i 個物種相對于所有物種的豐富度（即個體數(shù)/總個體數(shù)），其中， s 是樣品中OTUS數(shù)量， N 是序列總數(shù)， n₁ 是只有一條序列的OTU數(shù)目， n₂ 是只含有兩條序列的OTU數(shù)目， n_i 是第 i 個OTU所含有的序列數(shù)， S_abund 是高豐富度物種（豐度 gt;10）;S_rare 是稀有物種（豐度 ?10 且不為0）； F₁ 是豐度 =1 的物種（single-ton）， C_ACE 是樣本覆蓋度的估計值； γ²ACE 是稀有物種的變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌分離結(jié)果

本研究從120塊（段）健康管花秦蘇組織中分離到了76株內(nèi)生真菌（圖1），內(nèi)生真菌總定殖率為 50‰ ，總分離率為 63.33% ，說明其內(nèi)生真菌非常豐富。管花秦芃不同組織之間內(nèi)生真菌定殖和分離亦存在差異，在根部分離得到24株菌，分離頻率為 80% ，花、莖、葉中分離得到16、20、17株菌，分離頻率分別為 53.33%.66.67% 和56.67% （表1）。

2.2管花秦內(nèi)生真菌形態(tài)學鑒定

觀察并記錄菌株在培養(yǎng)過程中的形態(tài)特征，培養(yǎng)時間均為15d，形態(tài)學特征和菌絲顯微特征見圖1。將純化菌株的菌落特征與菌絲特性的觀察結(jié)果與《真菌鑒定手冊》進行比較，初步鑒定分離所得內(nèi)生真菌，形態(tài)學特征描述見表2。菌株的顏色主要是棕色和黑色等顏色，菌落主要呈圓形，其次為橢圓形，菌絲大部分都很細長，通過菌落及顯微鏡菌絲形態(tài)初步鑒定劃分為63種，通過ITS序列分析進行分子生物學鑒定。

2.3管花秦蘇內(nèi)生真菌ITS序列分析

有63株菌株根據(jù)菌株的ITS序列到Gen-Bank中尋找同源性 98% 的序列進行比對，再結(jié)合菌落和其他形態(tài)特征確定種級歸屬，其余13株可采用形態(tài)特征將其準確鑒定到屬，并歸類到上述菌株所在菌屬。經(jīng)分析，76株管花秦芃生真菌歸屬在7個綱、11個目、19個科和22個屬共41種（表1），內(nèi)生菌的種類非常豐富。從總體分離頻率分布來看，鏈格孢屬（Aternaria）（19.74% ）、鐮刀菌屬（Fusarium）（ （19.74% ）和曲霉屬（Aspergillus） （15.79%） ）為優(yōu)勢菌群。分離部位的優(yōu)勢菌群存在差異，曲霉屬（Aspergius）菌株在植物4個部位中均有存在，根中優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬（Fusarium）和曲霉屬（Aspergillus），花中為曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusari-um）和木霉屬（Trichoderma），莖中為鐮刀菌屬（Fusarium）和鏈格孢屬（Alternaria），葉中為鏈格孢屬（Alternaria）和曲霉屬（Aspergillus）。

2.4管花秦內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)前述BLAST比對分析結(jié)果，選取22個屬的近緣種的菌株，相似度均大于 99% 。利用聚類分析MEGA11中的Neighbor-Joining程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析管花秦芃的內(nèi)生真菌各菌株的親緣關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。大部分菌株都屬于子囊菌門，其中有26株屬于糞殼菌綱，19株屬于座囊菌綱，錘舌菌綱最少只有1株。

NCBI中下載的相似菌株序列均與試驗獲得的菌種聚類在一起，表明這些菌株應為同一種屬。不同綱之間菌株明顯分開。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示出各菌株與其相似菌株的關(guān)系與BLAST比對結(jié)果一致，各菌株分類位置清晰。

2.5 內(nèi)生真菌 a 多樣性分析

不同組織部位管花秦蘇可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性分析表明（圖3），不同組織所分離出來的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)不同，其多樣性水平存在差異，管花秦蘇內(nèi)生真菌的Richness指數(shù)、Shannon-Weiner多樣性指數(shù)及Simpson指數(shù)在不同組織之間的變化趨勢一致，根中的各指數(shù)最高，說明管花秦芃根中內(nèi)生真菌擁有豐富的多樣性。

2.6管花秦內(nèi)生真菌主坐標（PCoA）分析及非度量多維尺度分析（DMDS）

如圖4-A所示，管花秦芃不同組織內(nèi)生真菌的PCoA分析中第一主成分解釋了群落結(jié)構(gòu)22.88% 的方差，第二主成分解釋了 15.85% 的方差，第一、第二主成分共解釋了 38.73% 的方差。不同組織間內(nèi)生真菌群落的置信區(qū)間有著顯著的偏差 （Plt;0.05） 。

不同組織內(nèi)生真菌的NMDS分析如圖4-B所示，其應力函數(shù)值stress lt;0.2 ，表明其分析結(jié)果準確可靠。葉部位內(nèi)生真菌與其他部位內(nèi)生真菌彼此分離。

3討論

植物內(nèi)生真菌的組成在促進植物健康和適應方面起著重要作用[24]。本研究從管花秦蘇中分離培養(yǎng)出76株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學鑒定和ITS序列分析鑒定分別屬于子囊菌門、擔子菌門和毛霉門，分別屬于7綱11目22屬。其中子囊菌門是管花秦蘇內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌門，在屬水平上，鐮刀菌屬是根、花和莖部位的共同優(yōu)勢屬。鏈格孢屬和曲霉屬在管花秦芃的4個部位中都存在（表2）。研究發(fā)現(xiàn)麻花蘇的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬和鐮刀菌屬[25，在紅花龍膽和粗莖秦蘇的根際土壤中，最優(yōu)勢屬均為鐮刀菌屬[24，26]，這與本研究結(jié)果一致。同樣，相關(guān)研究也證明這些屬在藥用植物中普遍存在[26]。這可能與這些屬的菌株繁殖能力較強或培養(yǎng)方法有利于其生長有關(guān)。與其他屬相比，這些菌絲表現(xiàn)出加速的生長、提高的孢子形成率、更大的相對豐度和更廣泛的宿主范圍[25-27]。本研究從管花秦芃中分離得到的內(nèi)生真菌很多是傳統(tǒng)病原菌，如鏈格孢屬和鐮刀菌屬，鏈格孢屬內(nèi)生真菌可侵染多種農(nóng)作物，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[28]。但作為內(nèi)生真菌定殖時對宿主植物是有益的，可以促進植物生長或提高抗逆性[18]。鏈格孢屬內(nèi)生真菌定殖鹽脅迫條件下的番茄植株具有更高的根莖生物量，同時還通過降低活性氧含量以應對鹽脅迫[29]。

能產(chǎn)生128個有開發(fā)利用價值的次級代謝產(chǎn)物，包括可開發(fā)利用次級代謝產(chǎn)物（抗蟲、抗菌和抗腫瘤）和其他有利用價值產(chǎn)物（抗病毒、抗炎癥、抗氧化、除草和抑制浮游生物）[30]。鐮刀菌是一類起源于印度，世界性分布的真菌，因其分生孢子呈船狀或月牙狀而得名，屬兼性寄生菌或腐生菌，具有分布范圍廣、產(chǎn)孢能力很強、生存力極強、遺傳性復雜、寄主品種多樣等特點[31-36]。從棉花中分離的鐮刀菌屬在平板對峙中能明顯抑制強致病力菌株大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）的生長，用發(fā)酵濾液灌根后可誘導棉花葉片中朕脹質(zhì)積累，苯丙氨酸解氨酶基因、過氧化物酶基因和病程相關(guān)蛋白基因等基因的表達也有所上調(diào)[37]。曲霉菌屬（Aspergillussp.）也是常見的植物根際促生真菌種類之一，增強土壤肥力以及提高作物產(chǎn)量的同時還能改善土壤結(jié)構(gòu)。王妍等[38]從根際土壤中篩選得到一株土曲霉（Aspergillusterreus）MR-97對尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、灰葡萄孢等8種常見病原菌具有較強的抑菌效果并對防風等中藥材作物有明顯的促生作用。張熙等[39]報道黑曲霉能產(chǎn)生脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等。因此，這些優(yōu)勢內(nèi)生真菌菌屬在管花秦蘇的不同部位中具有獨特的生態(tài)位，可能對宿主的適應高原極端環(huán)境具有重要的作用。

值得注意的是，筆者分離的菌株中也有一些相對不常見的菌株，如假性小毛球?qū)伲–haet-osphaeronema）盾殼霉屬（Coniothyrium）、假鬼傘屬（Coprinellus）、亞球殼屬（Sphaerulina）淡領(lǐng)瓶霉屬（Cadophora）等。這些菌株可能由于寄生頻率低或培養(yǎng)條件不合適而具有低的分離頻率。王靜等[40]研究表明，輻毛小鬼傘（Coprinel-lusradians）能在兩個月內(nèi)促進杜鵑蘭種子萌發(fā)長出原球莖，這可能是因為杜鵑蘭種子從共生真菌中獲得營養(yǎng)成分[41]，也可能是輻毛小鬼傘降解了杜鵑蘭種皮中的纖維素，導致萌發(fā)變得更容易[42]。暗隔膜內(nèi)生菌（DSE）是子囊菌門中一類具有高黑色素生成活性的根定殖真菌。從加拿大西部云杉根中分離的淡領(lǐng)瓶霉（Cadophora sp.）的定殖能夠提升植物對磷和氮的吸收能力，顯著促進鹽脅迫下植物的生長[43]。盾殼霉屬（Conio-thyriumsp.）是核盤菌上一種重要的重寄生真菌[44]。其對于核盤菌菌核病的防治有著巨大的應用潛力，同時對人畜安全、對環(huán)境無污染，無殘留，是最具有潛力的生防農(nóng)藥之—[45]。王慶云[46]用盾殼霉發(fā)酵液浸種向日葵種子后，發(fā)現(xiàn)向日葵的株高，干質(zhì)量顯著提升，葉片內(nèi)SOD活性顯著高于對照。這些菌株也代表了新微生物資源的重要來源。研究表明，稀有類群在真菌共生網(wǎng)絡和生態(tài)系統(tǒng)功能（包括作物產(chǎn)量和土壤酶活性）中發(fā)揮著重要作用[47]。

在 α 多樣性分析中，管花秦芃不同部位分離得到的內(nèi)生真菌組成有明顯的差異，根和莖真菌多樣性高于花和葉，根中的真菌豐富度也最高，花和葉的真菌多樣性（Shannon和Simpson）沒有顯著差異。PCoA分析和DMDS分析也表明，不同組織間內(nèi)生真菌群落的置信區(qū)間有著顯著的偏差。內(nèi)生真菌在根中的定殖率比較高，這與麻花蘇內(nèi)生真菌的分布結(jié)構(gòu)相似[25]，這可能是由于與地上部分相比，地下部分表現(xiàn)出更長的存活時間。且在植物整個生命周期中，根部生長發(fā)育最早，發(fā)育時間也最長，有利于真菌的生長定殖，且根際土壤環(huán)境復雜，真菌和細菌種類豐富土壤中存在的大量真菌亦可人侵根部組織從而演變?yōu)閮?nèi)生真菌[48]。也可能是由于植物不同組織內(nèi)部的物理和生化屏障引起的強烈選擇壓力[49]。此外，花的內(nèi)生真菌多樣性略大于葉，這與燈盞花各組織內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中相似[50]，可能是因為花是植物的繁殖器官，具有復雜的結(jié)構(gòu)和功能，這些結(jié)構(gòu)可能為內(nèi)生真菌提供更多的生態(tài)位和生存空間，且花之間的傳粉也可能促進內(nèi)生真菌的傳播，從而促進了內(nèi)生真菌的多樣性。由于大量的內(nèi)生真菌不能培養(yǎng)或未分離到，受限于數(shù)據(jù)量的限制也可能會造成莖、葉和花中真菌數(shù)量較少。

4結(jié)論

本研究從生長于高寒草甸的管花秦芃中共分離并鑒定得到76株內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學鑒定以及真菌ITS序列分析發(fā)現(xiàn)分屬于7個綱、11個目、19個科、22個屬共41種。其中鏈格孢屬（Al-ternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium）是其優(yōu)勢菌屬。多樣性結(jié)果表明，管花秦可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的分布存在明顯組織差異。不同組織部位的內(nèi)生真菌多樣性由大到小為根 gt; 莖 gt; 花 gt; 葉，且根中的多樣性顯著高于葉。

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Isolation and Identification of Culturable Endophytic Fungi from Gentiana siphonantha Maxim

HU Xingqiang ^1，2 ， ZHENG Kun1，2，YE Xing1，2 and ZHOU Dangwei1，2.3 （1.CollgofPharmacyQinghaiMinzuUniversity，Xiningoo7，China；2.KeyLaboratoryofPhytochemistryofQinghai-ibetan Plateau，Xining1oo7China；3.ServiceStationofSci-TechCommisioner，Hiyan County，Haibei Qinghai822Cina）

Abstract To investigate the species composition and tissue一specific distribution of culturable endophytic fungi in Gentiana siphonantha Maxim，endophytic fungi were isolated from plants growing in alpine meadows using a tissue segment isolation method. The isolated fungi were identified based on morphological characteristics，ITS sequence analysis，and phylogenetic reconstruction. A total of 76 strains were obtained from roots，stems，leaves，and flowers，representing 7 classes，1l orders，19 families，22 genera，and 4l species. Among these，Alternaria （19.74% ），F(xiàn)usarium（ 19.74% ），and Aspergillus （15.79% ）were identified as the dominant genera. The diversity analysis of endophytic fungi in different tissues of G . siphonantha showed that the highest diversity index occurred in roots，followed by stems，flowers，and leaves. Although the distribution of endophytic fungi varied among tissues，the roots were identified as the primary site of colonization and infection. This study provides a preliminary yet comprehensive overview of the diversity of culturable endophytic fungi associated with G . si? phonantha ，and also lays a foundation for their further development and application.

Key words Gentiana siphonantha Maxim. ; Endophytic fungi; Isolation; Identification; Diversity

Received 2024-11-20 Returned 2024-12-09

Foundation itemQinghai Province Science and Technology Commissioner Specialist Project （No. 2024-NK-P11）.

First authorHU Xingqiang，male，master student. Research area：microbiology. E-mail：2896696938 @ qq. com

Corresponding authorZHOU Dangwei，male，Ph. D，professor. Research area： plant molecular biology.E-mail ：dangweizhou@sina. com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）