鹽酸可樂(lè)定（Clonidinehydrochloride，CLO）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腎上腺素 α₂ -受體激動(dòng)劑，常作為抗高血壓藥物[1-2]。CLO主要通過(guò)刺激腦干α₂ -腎上腺素受體導(dǎo)致交感神經(jīng)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳出減少，從而降低外周阻力、腎血管阻力、心率以及血壓，也有用于手術(shù)后的麻醉和鎮(zhèn)痛[3-4]。有研究表明CLO具有改善胴體品質(zhì)的作用，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示在豬飼糧中添加 0.5mg/kg 的CLO，能顯著提高豬的瘦肉率和眼肌面積，降低脂肪比率和背膘厚，推斷其主要的作用機(jī)理為通過(guò)促進(jìn)下丘腦生長(zhǎng)激素釋放激素神經(jīng)元合成和釋放生長(zhǎng)激素釋放激素，進(jìn)而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素分泌，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[5]。但是，在動(dòng)物組織中累積的CLO殘留可能造成食物中毒，對(duì)人體消化道、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)造成影響，引起頭暈、乏力、嗜睡、惡心、嘔吐以及神經(jīng)癥狀等[6]。2010年12月，原農(nóng)業(yè)部1519號(hào)公告已明確將CLO列人了《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》清單[7]。因此，加強(qiáng)對(duì)CLO殘留的檢測(cè)方法研究尤為必要。

目前，用于CLO殘留檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜法（High performance liquid chroma-tography，HPLC）[8]、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[9-10]等。然而這些方法的樣品前處理較為繁瑣，操作較為耗時(shí)，對(duì)儀器設(shè)備要求較高，對(duì)檢測(cè)效率產(chǎn)生較大影響。抗原與抗體特異性結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因其簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留及畜禽疫病的監(jiān)控檢測(cè)[1-12]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的免疫層析試紙（Immunochromatographicstrip，ICS）可在短時(shí)間內(nèi)（ 10min 左右）得到結(jié)果，更適合大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。但目前針對(duì)CLO殘留檢測(cè)的ICS研究仍較為缺乏。本研究在制備CLO鼠源單克隆抗體（Monoclonalantibody，mAb）的基礎(chǔ)上，基于競(jìng)爭(zhēng)模式研制檢測(cè)CLO的ICS方法，為高效監(jiān)控CLO殘留提供有力技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與耗材CLO、苯乙醇胺A（PhenylethanolamineA，PA）、沙丁胺醇（Salbu-tamol，SAL）鹽酸克倫特羅（Clenbuterolhydro-chloride，CL）、萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）、弗氏完全佐劑（Freund’s completeadjuvant，F(xiàn)CA）、弗氏不完全佐劑（Freund’sincompleteadjuvant，F(xiàn)IA）、牛血清白蛋白（Bovine serum al-bumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、PEG-1500、鼠源mAb 亞型鑒定試劑盒均為 Sig-ma公司產(chǎn)品；鹽酸阿可樂(lè)定（Apraclonidinehydrochloride，ACLO）購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究所；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（Goatantimouse IgG-HRP， GaMIgG^-HRP， 為武漢艾美捷科技公司產(chǎn)品；HAT 培養(yǎng)基（HAT media sup-plement （ 50×） Hybri-Max）、HT培養(yǎng)基（HTmedia supplement（ 50×） Hybri-Max），葡萄球菌凝集素A（Staphylococal protein A，SPA）為美國(guó)Thermofisher公司產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；無(wú)血清細(xì)胞凍存液購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司；其他試劑均為市售分析純及以上。包被液（CBS， pH9.6 的0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液）、稀釋液（PBS， pH7.4 的0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液）、洗滌液（PBST，含0.5% 吐溫-2O的PBS溶液）、封閉液（含 5% 脫脂奶的PBST溶液）、顯色液（TMB）；終止液L ?2mol/L 的稀硫酸）由實(shí)驗(yàn)室配制。硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜、吸水墊、聚苯乙烯硬板和玻璃纖維紙購(gòu)自上海金標(biāo)生物有限公司。

1.1.2主要儀器DYY-6C電泳儀，大連杰邁科技有限公司； H1650R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；MultiskanFC酶標(biāo)儀，3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)ThermoFisherScientific公司;ChemiDocXRS + 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；TSR3000讀條儀，美國(guó)Bio-Dot公司；三維劃膜噴金儀，上海金標(biāo)生物有限公司。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物和瘤細(xì)胞6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，小鼠SP2/O骨髓瘤細(xì)胞由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.乙.1CLU干兄座抗體時(shí)制奮及金定CLU分子質(zhì)量較小，沒(méi)有免疫原性。因此，需要通過(guò)與蛋白載體偶聯(lián)形成大分子復(fù)合物才能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。但CLO的分子結(jié)構(gòu)中缺乏能夠與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)，無(wú)法與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。CLO的衍生物ACLO與其結(jié)構(gòu)相似，苯環(huán)上的氨基為偶聯(lián)載體蛋白制備人工抗原提供了活性基團(tuán)（圖1）。因此，本研究將ACLO作為半抗原，采用重氮化法將ACLO分別與載體蛋白BSA 和OVA 偶聯(lián)[13]，制備免疫原CLO-BSA和包被原CLO-OVA。將CLO-BSA以 0. 15μg/200μL 的劑量免疫4只BALB/c小鼠，共免疫4次，每次間隔21d，首次免疫將CLO-BSA與FCA等體積乳化，后3次加強(qiáng)免疫將FCA替換為FIA。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（IndirectELISA，i-ELISA）和間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（Indirect competitive ELISA，ic-ELISA）對(duì)免疫后的小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)[14]。i-ELISA 測(cè)定血清抗體效價(jià)簡(jiǎn)要操作如下：用CBS將包被原CLO-OVA 稀釋為 1μg/mL ，每孔 100μL 包被于酶標(biāo)板中，再用封閉液封閉；檢測(cè)血清時(shí)，每孔加入 100μL 倍比稀釋的多抗血清并以PBS 為空白對(duì)照， 孵育 15min 后洗板；然后每孔加入100μL 用封閉液稀釋的 GaMIgG-HRP，37^°C 孵育 30min 后洗板；最后每孔加入 100μL 顯色液，10min 后加入終止液終止顯色；用酶標(biāo)儀讀取各孔 OD_450nm 值，判定 OD_450nm 值大于0.2且大于空白孔 OD_450nm 值2.1倍的孔為陽(yáng)性，以陽(yáng)性孔對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)作為血清效價(jià)。ic-ELISA鑒定敏感性的簡(jiǎn)要操作如下：將不同質(zhì)量濃度的CLO標(biāo)準(zhǔn)溶液以每孔 100μL 加入CLO-OVA包被的酶標(biāo)板中，并以PBS為對(duì)照，再加入等體積的稀釋血清， 孵育 15min 后洗板，后續(xù)操作同上述效價(jià)測(cè)定；以抑制率 B/B₀ （B為CLO標(biāo)準(zhǔn)溶液孔 OD_450nm 值， B₀ 為對(duì)照孔 OD_450nm 值）為縱坐標(biāo)、CLO質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（Half inhibitory concen-tration， IC₅₀ ），以評(píng)價(jià)血清敏感性。

選擇效價(jià)高、敏感性最好的小鼠作為融合對(duì)象，將抗原用無(wú)菌的PBS 稀釋后，以 0.5μg/μL 的劑量腹腔注射小鼠，進(jìn)行沖擊免疫，并采用雜交瘤技術(shù)制備 CLO-mAb 。取小鼠脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞在PEG1500的作用下進(jìn)行融合，融合10d左右，待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)板孔底的三分之一左右，收集上清液，用i-ELISA和ic-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，篩選獲得穩(wěn)定分泌CLO-mAb的陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株，細(xì)胞株凍存并擴(kuò)大培養(yǎng)。采用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水，采用辛酸一硫酸銨沉淀法純化腹水中的CLO-mAb并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行純化效果鑒定[15-16]。對(duì)CLO-mAb 的亞型、親和力、敏感性、特異性等免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定，亞型利用鼠源mAb亞型鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，親和力通過(guò)間接ELISA飽和法測(cè)定親和常數(shù) （K_m） 進(jìn)行評(píng)價(jià)[17]，敏感性和特異性通過(guò)ic-ELISA測(cè)定 IC₅₀ 和交叉反應(yīng)率（Crossreactivity，CR）進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中特異性鑒定利用PA、SAL、CL、RAC等常見(jiàn)受體激動(dòng)劑藥物作為競(jìng)爭(zhēng)物，以 IC₅₀ （CLO）/ IC₅₀ （競(jìng)爭(zhēng)物）計(jì)算CR[18]。

1.2.2膠體金溶液的制備及抗體的標(biāo)記根據(jù)Sun等[19]報(bào)道的方法，采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金（Aunanoparticles，AuNPs）溶液， 4^°C 條件下保存，備用，采用透射電鏡（Transmissione-lectronmicroscopy，TEM）對(duì)AuNPs進(jìn)行表征。對(duì)AuNPs標(biāo)記CLO-mAb的條件進(jìn)行優(yōu)化，包括AuNPs溶液的 ΔpH 和 CLO-mAb 標(biāo)記量。通過(guò)向 AuNPs 溶液中加入不同體積 0.2mol/L 的K₂CO₃ 溶液調(diào)節(jié)其 ΔpH 。最佳抗體標(biāo)記量通過(guò)以下試驗(yàn)確定。首先用雙蒸水（DDW）將CLO-mAb在稀釋杯中進(jìn)行倍比稀釋，隨后分別加入125μL AuNPs溶液（不同 ，室溫靜置 5min 后，加入 125μL 1% NaCl溶液，根據(jù)AuNPs溶液顏色的變化確定最佳的CLO-mAb標(biāo)記量，選擇AuNPs溶液將要變灰的孔所對(duì)應(yīng)的抗體量記錄為最佳標(biāo)記量。

在最佳的 pH 和抗體標(biāo)記量條件下進(jìn)行CLO-mAb標(biāo)記，室溫反應(yīng) 30min ，然后加人100μL （20 10% BSA溶液，室溫封閉 30min 。最后，

離心 15min ，棄去上清液，重懸于 200μL 的HB緩沖液（含 2% BSA、 4% 蔗糖和 0.02% 疊氮化鈉的硼酸鹽緩沖液）中，并在4^°C 條件下保存。

1.2.3ICS的組裝ICS的結(jié)構(gòu)示意圖如圖 2-a 所示。主要由樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊和底板組成。參照Russo等[20]的方法對(duì)樣品墊進(jìn)行處理。用劃膜噴金儀在結(jié)合墊上噴涂金標(biāo)抗體（AuNPs-mAb），噴涂量為 5μL/cm ，在NC膜上噴涂劃出檢測(cè)線（Testline，T線）和質(zhì)控線（Con-trolline，C線），T線上噴涂CLO-BSA，C線上噴涂SPA，按照樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊的順序組裝好后，用切條機(jī)切割成 3mm 寬的試紙，裝八山均衣，主血」一床懷竹。

1.2.4ICS的檢測(cè)原理及程序ICS的檢測(cè)原理如圖 2-b，2-c 所示，將待測(cè)樣品滴在樣品墊上，在虹吸作用下溶液向吸水墊的末端遷移。ICS基于競(jìng)爭(zhēng)模式，對(duì)于陰性樣品（不含CLO），結(jié)合墊上的AuNPs-mAb移至T線時(shí)會(huì)被CLO-BSA捕獲，多余的 AuNPs–mAb 流經(jīng)C線時(shí)被SPA捕獲，T線和C線將出現(xiàn)兩個(gè)深紅色帶。對(duì)于陽(yáng)性樣品（含有CLO），樣品中的CLO與T線上的CLO-BSA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AuNPs-mAb，T線的顏色會(huì)隨著CLO濃度的增加而變淺直至消失。無(wú)論樣品中是否含有CLO，C線都應(yīng)該顯色，否則試紙無(wú)效。ICS的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為 10min ，結(jié)果可通過(guò)裸眼直接觀察T線顏色進(jìn)行判定，也可使用讀條儀掃描T線相對(duì)光密度值（Relativeopticaldensity，ROD），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度進(jìn)行定量。1.2.5ICS的性能評(píng)估為評(píng)估ICS的視覺(jué)檢測(cè)靈敏度，將CLO用PBS稀釋為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于ICS檢測(cè)，同時(shí)，也用ICS檢測(cè)不同濃度的ACLO標(biāo)準(zhǔn)溶液，將ICS的T線顏色消失的最低濃度作為消線值，根據(jù)消線值高低判斷ICS 對(duì)于CLO和ACLO的檢測(cè)能力[21]。

在實(shí)際樣品檢測(cè)中，腎上腺素受體激動(dòng)劑常用的檢測(cè)樣品為豬尿，但豬尿中基質(zhì)復(fù)雜，會(huì)對(duì)ICS的檢測(cè)效果產(chǎn)生較大影響。為消除基質(zhì)效應(yīng)，向豬尿中加入適當(dāng)濃度的陰離子表面活化劑十二烷基硫酸鈉（SDS），并對(duì)其添加量進(jìn)行優(yōu)化，以消除豬尿中基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。在此基礎(chǔ)上，用豬尿稀釋7個(gè)濃度水平（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和 0ng/mL） 的CLO溶液，用ICS分別平行測(cè)3次，然后用讀條儀掃描T線ROD值。以抑制率 B/B₀ （B為各濃度ROD值， B₀ 為零濃度ROD值）為縱坐標(biāo)，CLO質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算 IC₅₀ 和 10% 抑制濃度（ IC₁₀ ）作為檢測(cè)限，用以評(píng)估ICS的靈敏度[22]。

最后進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，將CLO添加至豬尿中，配制3個(gè)濃度水平（0.5、1和 ）的樣品，用相同批次的ICS檢測(cè)樣品進(jìn)行批內(nèi)試驗(yàn)，用3個(gè)不同批次的ICS檢測(cè)樣品進(jìn)行批間試驗(yàn)，每個(gè)ICS平行測(cè)3次，根據(jù)加標(biāo)回收率和變異系數(shù)（Coefficientofvariation，CV）評(píng)估ICS的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLO-mAb的制備和鑒定

采用重氮化法制備CLO人工抗原，免疫BALB/c小鼠后，利用細(xì)胞融合技術(shù)篩選獲得1株可穩(wěn)定分泌CLO-mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為34-F10。制備的腹水及其純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖3-a所示，腹水樣品有許多雜帶，而純化后的CLO- mAb 只含有兩條帶（輕鏈和重鏈）。 CLO-mAb 的亞型鑒定結(jié)果如圖3-b所示，分泌的抗體重鏈為 IgG1 類，輕鏈為 κ 型。采用間接ELISA飽和法測(cè)定CLO-mAb的 K_m ，繪制曲線如圖3-c所示，通過(guò)計(jì)算可得 K_m 為1.65×10⁹L/mol ，屬于高親和力抗體 （K_m 為 10⁷ ～10¹²L/mol）^[23] 。ic-ELISA 測(cè)定 CLO-mAb 的IC₅₀ 為 0.188ng/mL ，表明敏感性較高；其他常見(jiàn)受體激動(dòng)劑藥物（PA、SAL、CL和RAC）作為競(jìng)爭(zhēng)物的 IC₅₀ 均大于10 μg/mL ，CR小于0.002% ，表明無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.2AuNPs的表征及最優(yōu) pH 和抗體標(biāo)記量的 確定

對(duì)制備的 AuNPs 進(jìn)行TEM表征，如圖 4-a 所示，制備的 AuNPs 分散均勻，粒徑為 25nm 左右。分別測(cè)定4種不同 pH 時(shí)AuNPs的抗體最佳標(biāo)記量，結(jié)果如圖4-b所示，加入 1μL，2μL 、3μL，4μLK₂CO₃ 的 AuNPs 溶液所對(duì)應(yīng)的最佳抗體標(biāo)記量分別為 0.5μL，0.5μL，1μL，2μL ，選擇 AuNPs 顏色未發(fā)生變化的最低抗體濃度為最低穩(wěn)定量，因此，確定AuNPs最適標(biāo)記 pH 的K₂CO₃ 添加量為 1μL ，最佳抗體標(biāo)記量為0.5μL 。

2.3 ICS的視覺(jué)檢測(cè)

將CLO和ACLO標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋為不同濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0ng/mL） ，用ICS檢測(cè)后評(píng)估視覺(jué)檢測(cè)靈敏度。結(jié)果如圖5所示，CLO和ACLO對(duì)ICS的T線消線值均可達(dá)到 2.5ng/mL ，表明ICS的視覺(jué)檢測(cè)靈敏度較高，可用于CLO和ACLO的殘留檢測(cè)。

2.4豬尿樣品檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果表明，表面活性劑SDS可以明顯消除基質(zhì)效應(yīng)，且不影響ICS的靈敏度，結(jié)果如圖6-a所示，ICS的T線在SDS的處理下能產(chǎn)生穩(wěn)定的顯色。同時(shí)，試驗(yàn)確定了表面活性劑SDS的最佳用量，結(jié)果如圖6-b所示，隨著SDS濃度的增加，C線的顏色變淺甚至消失，其原因可能是過(guò)量的SDS會(huì)破壞AuNPs和 mAb 之間的結(jié)合力，引起AuNPs和mAb解離，從而導(dǎo)致C線不顯色。試驗(yàn)結(jié)果表明， 0.04% 的SDS為ICS消除豬尿樣品中基質(zhì)效應(yīng)的最佳添加量。在優(yōu)化條件下，用豬尿樣品將CLO標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為7個(gè)濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和 0ng/mL） ，并用ICS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6-c所示，確定目測(cè)檢測(cè)限為 2.5ng/mL 。用讀條儀掃描ICS的T線，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6-d所示，得到線性回歸方程為 y=-0.743 7x+0.382 7.R²=0.991 8. ICS的 IC₅₀ 為 ，檢測(cè)限（ IC₁₀ ）為0.202ng/mL ，表明ICS能夠滿足豬尿樣品中 CLO殘留的靈敏檢測(cè)。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)對(duì)ICS的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行評(píng)估。用豬尿樣品將CLO標(biāo)液稀釋為3個(gè)濃度水平（0.5、1和 ，分別用ICS進(jìn)行批內(nèi)和批間檢測(cè)。從表1的結(jié)果可知，批內(nèi)的平均回收率為8 2.79%～92 ： 96% ，CV為3.99%～7 . 08% 。批間的平均回收率為82.36%～89.09% ，CV為 4.05%～7.04% 。結(jié)果表明所研制的ICS的準(zhǔn)確度和精密度較高。

3討論

3.1 人工抗原制備

CLO屬于小分子化合物，自身無(wú)免疫原性?？乖哂忻庖咴酝ǔＰ枰浞肿淤|(zhì)量大于10ku ，因此，需將CLO偶聯(lián)載體蛋白方可刺激機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體。但小分子結(jié)構(gòu)上需具有相應(yīng)的活潑基團(tuán)才可與常用的含有大量羥基、氨基等活潑基團(tuán)的BSA、OVA等載體蛋白偶聯(lián)。通常，分子結(jié)構(gòu)上若含有氨基、羧基、羥基等活性基團(tuán)，可直接采用戊二醛法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法等偶聯(lián)方法；若無(wú)活性基團(tuán)則可通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾方法，引人端基為活性基團(tuán)的連接臂，再與載體蛋白偶聯(lián)[24]。CLO分子結(jié)構(gòu)上無(wú)活性基團(tuán)，前期試驗(yàn)嘗試通過(guò)化學(xué)修飾引入活性基團(tuán)，但人工抗原制備效果不佳。因此，從結(jié)構(gòu)類似物具有較強(qiáng)交叉反應(yīng)性的角度考慮，選擇類似物代替目標(biāo)物進(jìn)行偶聯(lián)，也可達(dá)到預(yù)期效果[25]。本研究根據(jù)CLO的分子結(jié)構(gòu)，選擇僅在苯環(huán)上多一個(gè)活性氨基的結(jié)構(gòu)類似物ACLO作為半抗原，采用重氮化法制備人工抗原，通過(guò)小鼠免疫、細(xì)胞融合、腹水制備等程序，達(dá)到了制備CLO-mAb的目的，且CLO-mAb的免疫學(xué)特性良好，K_m 處于高親和力抗體范圍， IC₅₀ 為0.188ng/mL ，且與其他常見(jiàn)受體激動(dòng)劑藥物無(wú)交叉反應(yīng)，敏感性和特異性良好，能夠?yàn)楹罄m(xù)ICS的研制提供有效的抗體保障。

3.2 基質(zhì)效應(yīng)

ICS作為應(yīng)用廣泛的快速檢測(cè)方法，在大批量樣品現(xiàn)場(chǎng)篩查中發(fā)揮著重要作用。在進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)，通常需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的樣品前處理，但一些樣品（如尿液、血液、動(dòng)物組織等）成分較為復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，不利于保持正常的檢測(cè)環(huán)境，影響抗體的性能和ICS檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度降低，甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[26]。因此，需要加入必要的手段來(lái)消除復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響。有研究通過(guò)篩選具有環(huán)境耐受性的抗體用于方法建立[27]，但通常會(huì)對(duì)ICS樣品墊或樣品稀釋液進(jìn)行優(yōu)化，以消除基質(zhì)效應(yīng)。本研究所研制的ICS針對(duì)的常用檢測(cè)樣品為豬尿，其中含有大量尿素、尿酸和無(wú)機(jī)鹽，若用PBS稀釋樣品，則檢測(cè)靈敏度會(huì)有所降低。已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，向豬尿中添加表面活性劑可減弱基質(zhì)效應(yīng)[28]，本研究嘗試添加表面活性劑SDS，并對(duì)其添加量進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)SDS能較好地消除基質(zhì)效應(yīng)，但SDS濃度過(guò)高時(shí)可能影響AuNPs和 mAb 之間的結(jié)合，導(dǎo)致ICS的C線不顯色，最終選擇 0.04% 的SDS作為消除樣品中基質(zhì)效應(yīng)的最佳添加量。

3.3 ICS的構(gòu)建及性能

用于ICS構(gòu)建的抗體標(biāo)記物種類繁多，其中AuNPs制備方法成熟，容易通過(guò)靜電作用與抗體結(jié)合，且不影響其生物活性，仍是目前應(yīng)用最為廣泛的抗體標(biāo)記物[29]。用于標(biāo)記抗體的AuNPs粒徑大多為 20～40nm^[30] ，本研究采用檸檬酸鈉還原法制備了粒徑為 25nm 左右且分散均勻的AuNPs，適合ICS的構(gòu)建。ICS的檢測(cè)模式主要分為夾心模式和競(jìng)爭(zhēng)模式，夾心模式也被稱為直接模式，通常用于含有多個(gè)抗原表位的大分子抗原物質(zhì)，能被不同抗體識(shí)別從而構(gòu)成夾心檢測(cè)，ICS的T線顯色與被檢靶標(biāo)的量成正比；而競(jìng)爭(zhēng)模式普遍應(yīng)用于小分子抗原檢測(cè)中，被檢樣品中的靶標(biāo)與T線上的人工抗原競(jìng)爭(zhēng)與特異性抗體結(jié)合，ICS的T線顯色與被檢靶標(biāo)的量成反比[31]。本研究將 AuNPs標(biāo)記具有良好免疫學(xué)特性的 CLO-mAb ，通過(guò)優(yōu)化標(biāo)記條件，基于競(jìng)爭(zhēng)模式構(gòu)建了ICS。通過(guò)對(duì)ICS檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)估，ICS能夠靈敏檢測(cè)CLO及其衍生物ACLO，視覺(jué)檢測(cè)消線值達(dá)到 2.5ng/mL ；讀條儀定量檢測(cè)的檢測(cè)限為 0.202ng/mL ，且具有良好的靈敏度與準(zhǔn)確度，雖與相關(guān)研究中用于豬尿CLO殘留檢測(cè)的ELISA試劑盒靈敏度等性能相當(dāng)[32]，但操作更加簡(jiǎn)易，檢測(cè)更為省時(shí)。本研究下一步仍需擴(kuò)大樣品種類，拓展ICS在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用范圍，并探索ICS中新型納米標(biāo)記材料的適用性，以及受體激動(dòng)劑藥物多靶標(biāo)的高通量檢測(cè)，并嘗試結(jié)合便攜式檢測(cè)裝置實(shí)現(xiàn)智能化檢測(cè)，進(jìn)一步提高CLO的監(jiān)控檢測(cè)效率。

4結(jié)論

本研究通過(guò)制備CLO人工抗原，經(jīng)小鼠免疫和細(xì)胞融合，篩選獲得了免疫學(xué)特性良好的CLO-mAb，在此基礎(chǔ)上，制備AuNPs并優(yōu)化pH和最佳抗體標(biāo)記量，采用競(jìng)爭(zhēng)模式構(gòu)建ICS，通過(guò)表面活性劑消除基質(zhì)效應(yīng)，并檢測(cè)豬尿樣品進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。ICS的視覺(jué)檢測(cè)消線值為2.5ng/mL ，通過(guò)讀條儀定量檢測(cè)，檢測(cè)限為0.202ng/mL 。加標(biāo)回收試驗(yàn)表明ICS具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，成功用于豬尿樣品中的CLO殘留的快速檢測(cè)，可為提升獸藥殘留監(jiān)控效率、保障動(dòng)物性食品安全提供有效支撐。

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Preparation of Monoclonal Antibodies and Development of Immunochromatographic Strips for Clonidine Hydrochloride

WANG Yao1 ，JING Yubing1 ，CAO Jinbo1'2，SUN Yaning2 ， XING Yunrui2，CHEN Xiujin1，LI Zhaozhou1 and HU Xiaofei' （1.Foodand Bioengineering Collge/Henan International Joint Laboratory of Food Green Processing and Quality Safety Control，Henan University of Science and Technology，Luoyang Henan 47looo，China; 2.KeyLaboratoryofAnimal Immunology，Henan AcademyofAgricultural Sciences，Zhengzhou450o02，China

Abstract Clonidine hydrochloride （CLO） is a novel alternative to traditional receptor agonist and is prohibited for use in feed and animal drinking water. The development of rapid detection methods for CLO is of great significance for improving the efficiency of monitoring veterinary drug residues and ensuring the safety of animal-derived food. In this study，murine monoclonal antibodies of CLO with high sensitivity and strong specificity were prepared，andan immunochromatographic strip （ICS） was developed for rapid detection of CLO residues based on a competitive model. The ICS cutoff value of ICS for visual detection was 2.5ng/mL ，and quantitative detection was conducted by a reader，and the detection limit was 0.202ng/mL . The results of pig urine samples recovery test showed that the intra-assay recovery rate of ICS ranged from 82.79% to 92.96% ，with a maximum coefficient of variation（CV）of 7.17% ，the inter-assay recovery rate of ICS ranged from 82.36% to 89.09% ，with the highest CV of 7.04% . ICS demonstrated high sensitivity and accuracy，providing a practical and rapid detection tool for the efficient monitoring of CLO residues.

Key wordsClonidine hydrochloride; Monoclonal antibody;Immunochromatographic strip； Rapid detection

Received 2024-04-30 Returned 2024-06-05

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No. 31702218）；Scientific and Technological Research Project of Henan Province （No.232102320298，No.242102321131）； Training Plan for Young Backbone Teachers in Higher Education Institutions of Henan Province （No. 2023GGJS046）； Postgraduate Education Reform and Quality Improvement Project of Henan Province （No. HNYJS202oJDo6）； Public Welfare Industry Scientific Research Project of Luoyang Municipality （No.2202021A）.

First author WANG Yao，male，Ph.D，associate professor. Research area： rapid detection technology of food safety. E-mail： wangyao@haust. edu.cn

Corresponding authorHU Xiaofei，male，Ph.D，research fellw. Research area： animal nutrition，food and feed immunoassay. E-mail： huxf1972@126.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）