【摘要】 目的 探討廣州地區(qū)口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）中EB病毒（EBV）、人乳頭狀瘤病毒（HPV）的感染及臨床病理特征。方法 收集廣州地區(qū)304例OSCC標(biāo)本，其中123例來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院（2014年1月至2024年12月），181例來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院（2017年1月至2018年12月）。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測病毒DNA，原位雜交分析EBV編碼小RNA（EBER）表達(dá)，免疫組織化學(xué)檢測病毒相關(guān)蛋白并明確感染類型。結(jié)果 在304例OSCC標(biāo)本中，26.3%（80/304）為EBV-PCR陽性，其中63.8%（51/80）確診于TNM分期的Ⅰ/Ⅱ期，與陰性標(biāo)本相比，腫瘤分期差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.042）。EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，EBER陽性率為33.8%（27/80），其中92.6%（25/27）定位于細(xì)胞質(zhì)。EBV核抗原1（EBNA-1）、潛伏膜蛋白1（LMP-1）及EBNA-2的檢出率分別為83.8%（67/80）、81.3%（65/80）和56.3%（45/80），EBV裂解蛋白ZEBRA未檢出，Ⅲ型潛伏感染占41.3%（33/80）。相比之下，HPV DNA檢出率僅2.6%（8/304），其中2例p16-IHC陽性，EBV-HPV共感染OSCC僅1例。結(jié)論 以中山大學(xué)附屬醫(yī)院標(biāo)本為例，廣州地區(qū)OSCC中EBV檢出率較高，以Ⅲ型潛伏感染為主，EBER主要定位于細(xì)胞質(zhì)，提示EBV可能在OSCC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。相比之下，HPV相關(guān)OSCC罕見，其致病作用有限。

【關(guān)鍵詞】 EB病毒；人乳頭狀瘤病毒；口腔鱗狀細(xì)胞癌；潛伏感染；臨床病理特征

Epstein-Barr virus and human papillomavirus infections and clinicopathological characteristics in oral squamous cell carcinoma in Guangzhou： a study based on specimens from affiliated hospitals of Sun Yat-sen University

LIANG Sihong1， SHAO Yiting2， LI Haigang3， DU Yu1， JI Yanying1，BAN Yuanyuan1， HU Wen1， CHEN Jianning1， SHAO Chunkui1

（1.Department of Pathology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China； 2.Department of Stomatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China； 3.Department of Pathology， Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China）

Corresponding author： SHAO Chunkui， E-mail： shaochk@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To investigate the infection status and clinicopathological characteristics of Epstein-Barr virus （EBV） and human papillomavirus （HPV） in oral squamous cell carcinoma （OSCC） in Guangzhou， China. Methods A total of 304 OSCC specimens were collected from Guangzhou， including 123 cases from the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University （January 2014 to December 2024） and 181 cases from Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University （January 2017 to December 2018）. Polymerase Chain Reaction （PCR） was used to detect viral DNA， in situ hybridization was used to assess EBV-encoded RNAs （EBER）， and immunohistochemistry was performed to identify viral-related proteins and determine the type of infection. Results Among the 304 OSCC specimens， 26.3% （80/304） were EBV-PCR positive， with 63.8% （51/80） diagnosed at TNM stage I/II. Compared with EBV-negative cases， the difference in tumor staging was statistically significant （P = 0.042）. Among the EBV-PCR-positive OSCC cases， the EBER-positive rate was 33.8% （27/80）， with 92.6% （25/27） localized in the cytoplasm. The detection rates of EBV-encoded nuclear antigen-1 （EBNA-1）， latent membrane protein-1 （LMP-1）， and EBV-encoded nuclear antigen-2 （EBNA-2） were 83.8% （67/80）， 81.3% （65/80）， and 56.3% （45/80）， respectively， while the lytic protein ZEBRA was not detected. Type III latent infection accounted for 41.3% （33/80）. In contrast， HPV DNA was detected in only 2.6% （8/304） of OSCC cases， among which two were p16-IHC positive. Only one case of OSCC showed EBV-HPV coinfection. Conclusions Based on samples collected from Sun Yat-sen University affiliated hospitals， EBV infection is relatively prevalent in OSCC cases in Guangzhou， mainly characterized by type III latency and cytoplasmic localization of EBER， suggesting a potential role of EBV in the pathogenesis of OSCC. In contrast， HPV-related OSCC appears to be rare and likely plays a limited pathogenic role.

【Key words】 Epstein-Barr virus； Human papillomavirus； Oral squamous cell carcinoma； Latency infection；

Clinicopathological characteristics

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，

OSCC）是口腔最常見的惡性腫瘤［1］，全球年新增約30萬例，死亡約14.5萬例［2-3］。OSCC的5年生存率長期維持在50%左右［4］。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）和人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可能在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，但不同研究結(jié)果存在較大差異，病毒檢出率在不同地區(qū)從0%～100%不等，其致癌機(jī)制仍不明

確［5-8］。廣州地區(qū)為鼻咽癌高發(fā)區(qū)，鼻咽癌與EBV感染密切相關(guān)，但OSCC與EBV的關(guān)系如何卻鮮有報道。一項(xiàng)小樣本研究提示EBV可能參與OSCC發(fā)生，但未對感染類型進(jìn)行分析［9］。HPV在廣州地區(qū)OSCC中的作用亦缺乏研究，一項(xiàng)針對舌鱗狀細(xì)胞癌的研究顯示，15.7%（19/121）標(biāo)本存在HPV DNA擴(kuò)增，且與男性患者相關(guān)。但該研究限于舌部OSCC，其普適性及代表性仍需進(jìn)一步確認(rèn)［10］。此外，近年來未有研究報道廣州地區(qū)EBV和HPV共同感染與OSCC的關(guān)系。因此，本研究以中山大學(xué)附屬醫(yī)院標(biāo)本為例，旨在探討廣州地區(qū)OSCC中EBV、HPV的感染及臨床病理特征，以深化對OSCC病因的理解。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究共收集304例原發(fā)性O(shè)SCC標(biāo)本，其中123例來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院（2014年1月至2024年12月），181例來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院（2017年1月至2018年12月）。所有患者術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療。為降低中心效應(yīng)，本研究嚴(yán)格統(tǒng)一病例納入標(biāo)準(zhǔn)、組織固定及保存方法，以確保不同中心樣本的處理一致性，從而提高數(shù)據(jù)的可比性。收集患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期，其中腫瘤分期依據(jù)《美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）TNM分期系統(tǒng)》第8版。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（批件號：中大附三醫(yī)倫II2024-075-02，中大附二醫(yī)倫SYSKY-2022-256-01），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

本研究主要使用以下試劑：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen）、2×Pro Taq PCR預(yù)混液（艾科瑞生物工程有限公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物（生工生物工程股份有限公司）、Novolink Max聚合物（Leica）及EBV編碼小RNA（EBV-encoded RNA，EBER）檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢測采用以下抗體及稀釋比例：EBNA-1（1∶2 000，Santa Cruz）、LMP-1（1∶1 500，Abcam）、EBNA-2（1∶300，Novus）、ZEBRA（1∶450，Santa Cruz）及p16（即用型，Roche）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用PCR檢測OSCC標(biāo)本中的EBV和HPV DNA，并通過原位雜交（in situ hybridization，ISH）分析EBER的表達(dá)。此外，利用IHC檢測EBV核抗原1（EBV-encoded nuclear antigen-1，EBNA-1）、EBV核抗原2（EBV-encoded nuclear antigen-2，EBNA-2）、潛伏膜蛋白1（latent membrane protein-1，LMP-1）及EBV裂解蛋白ZEBRA的表達(dá)，同時檢測p16INK4A（p16）蛋白，以評估EBV感染類型及HPV相關(guān)性。所有實(shí)驗(yàn)均在相同實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，采用統(tǒng)一的檢測平臺、試劑及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，并嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量控制措施，以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可比性。

1.4 標(biāo)本處理

所有組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定并行石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE），制備3.5 μm連續(xù)切片供后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.5 基因組DNA提取及PCR檢測

使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取OSCC組織DNA，按照制造商說明操作。提取的DNA通過超微量分光光度計測定濃度和純度，并儲存于-20 ℃以備PCR分析。經(jīng)β-珠蛋白基因PCR擴(kuò)增評估DNA提取質(zhì)量，見表1。采用MY09/MY11通用引物擴(kuò)增L1片段，以檢測多種HPV亞型［11］。使用特異性引物擴(kuò)增EBNA-1、EBNA-3C、BamHI-F和BamHI-W片段，其中EBNA-3C片段擴(kuò)增產(chǎn)物可區(qū)分EBV A型（153 bp）與B型（246 bp）［12］。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，98℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最終延伸1 min。每次PCR檢測均設(shè)相應(yīng)對照，以確保實(shí)驗(yàn)可靠性。陽性對照為HPV陽性宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變及EBV陽性鼻咽癌FFPE組織DNA，陰性對照為DEPC處理的無核酸去離子水。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測

根據(jù)試劑盒說明，采用Novolink Max聚合物檢測系統(tǒng)進(jìn)行IHC檢測，以分析EBV相關(guān)蛋白及p16的表達(dá)。顯微鏡下評估染色結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：≥1%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)明確陽性染色，則判斷為EBNA-1、LMP-1、EBNA-2或裂解蛋白ZEBRA陽性。p16陽性標(biāo)準(zhǔn)為≥70%的腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞核呈現(xiàn)強(qiáng)烈、彌漫的陽性染色。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，設(shè)置相應(yīng)對照。陽性對照包括宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變FFPE組織（p16陽性對照）、EBV陽性鼻咽癌FFPE組織（EBNA-1和LMP-1陽性對照）、B95-8細(xì)胞蠟塊（EBNA-2陽性對照）及EBV相關(guān)淋巴增生性疾病FFPE組織（ZEBRA陽性對照）。陰性對照使用磷酸鹽緩沖液（1×）替代一抗孵育。

1.7 原位雜交檢測

按照制造商說明，采用EBER檢測試劑盒進(jìn)行ISH檢測。顯微鏡下觀察染色情況，若腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或胞質(zhì)呈現(xiàn)陽性染色，則判定為EBER陽性［13］。EBER陽性鼻咽癌FFPE組織切片作為陽性對照，陰性對照則以磷酸鹽緩沖液（1×）替代探針處理。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ 2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OSCC中EBV DNA的擴(kuò)增及臨床病理特征

在OSCC標(biāo)本中，成功擴(kuò)增EBV基因組片段，包括BamHI-W（3.6%，11/304）、BamHI-F（11.2%，34/304）、EBNA-1（13.5%，41/304）和EBNA-3C（23.4%，71/304），見圖1。在80例（26.3%）EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，51例（63.8%）至少擴(kuò)增2種EBV片段，其中3例擴(kuò)增4種、20例擴(kuò)增3種、28例擴(kuò)增2種。所有EBNA-3C PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為153 bp，提示所有EBNA-3C陽性O(shè)SCC（100%，71/71）均感染A型EBV。

對EBV-PCR陽性O(shè)SCC患者的臨床病理特征進(jìn)行分析，見表2。結(jié)果顯示，I期為最常見TNM分期（37.5%，30/80），腫瘤原發(fā)部位以舌部為主（62.5%，50/80），其次為牙齦和頰黏膜（各13.8%，11/80），大部分唇部OSCC標(biāo)本為EBV-PCR陽性（3/4）。EBV-PCR陽性與陰性O(shè)SCC患者在腫瘤分期（P = 0.042）和腫瘤部位（P = 0.029）方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，陽性組中I/II期患者比例更高，部位以牙齦、頰黏膜及唇部構(gòu)為主。EBV-PCR陽性O(shè)SCC患者中，男性占65%（52/80），96.2%（77/80）為中-高分化OSCC，76.3%（61/80）無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。EBV-PCR陽性與陰性O(shè)SCC患者在性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P gt; 0.05）。

2.2 OSCC中EBER表達(dá)情況及臨床病理特征

在EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，33.8%（27/80）EBER表達(dá)陽性。EBER陽性標(biāo)本中，腫瘤細(xì)胞核及胞質(zhì)均可見不同程度的染色，見圖1。其中92.6%（25/27）主要定位于胞質(zhì)，僅7.4%（2/27）局限于細(xì)胞核。

EBER-ISH陽性O(shè)SCC標(biāo)本的臨床病理特征整體上與EBV-PCR陽性標(biāo)本相似。EBER-ISH陽性O(shè)SCC主要發(fā)生于舌部（59.3%，16/27），其次為牙齦（14.8%，4/27）和頰黏膜（11.1%，3/27）。此外，EBER-ISH陽性O(shè)SCC以男性為主（74.1%，20/27），所有標(biāo)本均為中-高分化型，且多數(shù)（74.1%，20/27）無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。EBER-ISH陽性與陰性O(shè)SCC患者在性別、年齡、部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P gt; 0.05）。

2.3 OSCC中EBV潛伏與EBV裂解蛋白ZEBRA的表達(dá)

在EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，EBNA-1、LMP-1和EBNA-2的陽性率分別為83.8%（67/80）、81.3%（65/80）和56.3%（45/80），見圖1。所有標(biāo)本均未檢測到EBV裂解蛋白ZEBRA（0/80）。結(jié)合EBV潛伏蛋白的表達(dá)模式［14-15］，可推測其潛伏感染類型，見表3。在71例EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，Ⅲ型潛伏感染占41.3%（33/80），特征為EBNA-1、EBNA-2和LMP-1均表達(dá)。Ⅱ型潛伏感染占36.3%（29/80），進(jìn)一步分為Ⅱa型（EBNA-1和LMP-1表達(dá)，28.8%，23/80）及Ⅱb型（EBNA-1和EBNA-2表達(dá)，7.5%，6/80）。此外，Ⅰ型潛伏感染占6.3%（5/80），僅表達(dá)EBNA-1。另有5.0%（4/80）標(biāo)本未檢測到EBV潛伏蛋白，可能為0型潛伏感染或EBV-PCR假陽性。其余11.3%（9/80）標(biāo)本的EBV潛伏感染類型尚不明確。

2.4 OSCC中HPV的感染情況

在304例OSCC標(biāo)本中，HPV DNA的檢出率為2.6%（8/304），見圖2。HPV-PCR陽性O(shè)SCC患者8例，包括6例男性和2例女性，年齡37～78歲，腫瘤原發(fā)部位涵蓋牙齦、舌部和頰黏膜。值得注意的是，僅2例患者（病例3和病例7）發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，所有病例病理類型均為高分化OSCC，見表4。由于樣本量有限，無法進(jìn)一步行統(tǒng)計分析。

在HPV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，僅2例（2/8）同時為p16-IHC陽性，歸類為HPV相關(guān)OSCC，見圖2。其中1例同時為EBV-PCR、HPV-PCR和p16-IHC陽性，提示EBV與HPV共同感染。該病例（病例2）為37歲女性，腫瘤原發(fā)于舌部，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期為I期，病理類型為高分化OSCC，見表4。此外，該標(biāo)本EBER-ISH檢測陽性，并表達(dá)EBNA-2、LMP-1及EBNA-2，提示為EBV的Ⅲ型潛伏感染。

3 討 論

OSCC是最常見的口腔惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與病毒感染，尤其是EBV和HPV的作用尚不明確。本研究中廣州2家醫(yī)院26.3%（80/304）的OSCC標(biāo)本存在EBV DNA擴(kuò)增，并顯示EBV-PCR陽性與陰性患者在腫瘤分期方面差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與傳統(tǒng)認(rèn)知不同，本研究顯示EBER主要定位于OSCC腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，而非細(xì)胞核。進(jìn)一步分析表明，EBV-PCR陽性O(shè)SCC主要為EBVⅢ型潛伏感染。此外，HPV相關(guān)OSCC僅占0.7%（2/304），而EBV-HPV共同感染病例僅0.3%（1/304）。這可在一定程度上反映廣州地區(qū)OSCC患者中EBV、HPV及其共同感染的情況和臨床病理特征。

本研究檢測到26.3%（80/304）的OSCC標(biāo)本存在EBV DNA擴(kuò)增，結(jié)果與既往研究相似［16-17］。然而，OSCC中EBV DNA檢出率在不同研究中差異較大。例如，Al-Thawadi等［18］報道在78.1%的OSCC標(biāo)本中檢測到EBV DNA，而Dayyani等［5］的研究則未檢出EBV DNA。這種差異可能與地理區(qū)域、樣本類型、標(biāo)本采集方式及檢測方法的不同有關(guān)［7］。為降低EBV-PCR在OSCC檢測中的假陰性率，本研究采用多EBV基因片段PCR擴(kuò)增策略，以提高檢測靈敏度。

EBV-PCR陽性O(shè)SCC患者的臨床病理特征分析顯示EBV-PCR陽性和陰性患者在腫瘤分期方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義。大多數(shù)EBV-PCR陽性O(shè)SCC病例確診于早期階段，且未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)提示，EBV相關(guān)OSCC患者可能具有更好的預(yù)后。這一結(jié)果與EBV相關(guān)胃癌的研究相似，即EBV陽性胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低于陰性患者，且預(yù)后更佳［19-20］。然而，考慮到不同癌癥類型的異質(zhì)性、潛在混雜因素的影響以及當(dāng)前研究數(shù)據(jù)的局限性，相關(guān)結(jié)論仍需謹(jǐn)慎解讀。未來研究需在更嚴(yán)格的控制下進(jìn)一步闡明EBV在OSCC發(fā)生和發(fā)展中的作用。

一般而言，EBER在EBV感染的所有潛伏期均可檢測到，因此EBER-ISH通常被視為EBV感染的金標(biāo)準(zhǔn)［21］。然而，在本研究中，僅33.8%的EBV-PCR陽性O(shè)SCC顯示EBER-ISH陽性。這一現(xiàn)象在先前研究中亦有報道，即部分EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本表現(xiàn)為EBER-ISH陰性［22］。這一現(xiàn)象可由“hit and run”假說解釋，即病毒感染的腫瘤細(xì)胞在獲得遺傳穩(wěn)定性后，可能會逐漸丟失病毒基因組［23］。類似地，一些EBER-ISH陰性的胃癌標(biāo)本仍可通過數(shù)字PCR檢測到EBV DNA，或通過RNA scope檢測到EBNA-1 mRNA，并可能伴隨病毒介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)改變［24］。本研究結(jié)果提示，OSCC組織中的EBER表達(dá)可能隨時間逐漸降低，最終導(dǎo)致EBER-ISH陰性，而PCR仍可檢測到殘存的EBV基因片段，并可能繼續(xù)發(fā)揮生物學(xué)作用。此外，IHC結(jié)果顯示，即使EBER-ISH陰性，部分OSCC標(biāo)本仍表達(dá)EBV編碼蛋白。因此，盡管EBER-ISH被廣泛認(rèn)為是EBV感染的檢測標(biāo)準(zhǔn)，其在EBV相關(guān)OSCC檢測中的可靠性仍需進(jìn)一步確認(rèn)。對于EBER-ISH陰性的OSCC標(biāo)本，可能需結(jié)合如本研究所用的多靶點(diǎn)PCR方法，以提高EBV檢測的敏感性和準(zhǔn)確性。

值得注意的是，在EBER-ISH陽性標(biāo)本中，92.6%的標(biāo)本主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)陽性染色，而僅7.4%（2/27）的標(biāo)本呈現(xiàn)細(xì)胞核陽性染色。這一發(fā)現(xiàn)提示EBER可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。Ahmed等［25］結(jié)合分子生物技術(shù)和電子顯微技術(shù)，觀察到EBER在EBV感染的B細(xì)胞系中同時定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。此外，Cheng等［26］的研究表明，EBER可存在于細(xì)胞囊泡內(nèi)，并通過外泌體途徑發(fā)揮作用。另外，EBER在細(xì)胞質(zhì)中的分布與雙鏈RNA依賴性蛋白激酶密切相關(guān)，可能通過與其相互作用參與蛋白調(diào)控［27］。本研究顯示，大多數(shù)EBER-ISH陽性O(shè)SCC標(biāo)本以細(xì)胞質(zhì)定位為主，提示EBER在細(xì)胞質(zhì)中的分布可能在OSCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

EBV編碼蛋白在EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中起關(guān)鍵作用。EBNA-1是EBV復(fù)制和致病過程中必不可少的蛋白，參與維持病毒基因組穩(wěn)定性，并介導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化［28］。LMP-1促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［29］。在本研究中，EBNA-1和LMP-1分別在83.8%和81.3%的EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中表達(dá)，提示其可能在OSCC的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

不同類型腫瘤中EBV感染模式的差異，凸顯了EBV與宿主細(xì)胞間的復(fù)雜相互作用。在EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，以Ⅲ型潛伏感染為主，該類型通常見于免疫抑制相關(guān)疾病，如移植后淋巴增生性疾病和HIV相關(guān)淋巴瘤［30］。本研究納入的OSCC患者均為未接受治療的初診病例，提示觀察到的EBV Ⅲ型潛伏感染可能與腫瘤微環(huán)境中的局部免疫抑制密切相關(guān)。相比之下，Heawchaiyaphum等［31］在OSCC細(xì)胞系中主要檢測到Ⅰ型或Ⅱ型潛伏感染，反映出臨床標(biāo)本與體外培養(yǎng)細(xì)胞模型在EBV感染類型上的差異，提示宿主-腫瘤相互作用可能影響EBV的潛伏機(jī)制。此外，部分EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本表現(xiàn)出Ⅱ型、0型及其他尚未明確的潛伏感染類型。需要注意的是，檢測方法靈敏度可能影響EBV潛伏蛋白的實(shí)際表達(dá)水平，進(jìn)而影響EBV感染類型分布的準(zhǔn)確評估。

本研究同時分析了OSCC標(biāo)本中HPV的感染狀態(tài)。盡管E6/E7 mRNA檢測被公認(rèn)為HPV診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其依賴于新鮮凍存組織且操作復(fù)雜，限制了其在臨床中的應(yīng)用［32］。有研究表明，HPV-PCR聯(lián)合p16-IHC在檢測mRNA陽性的口咽鱗狀細(xì)胞癌樣本時，具有93%的靈敏度和96%的特異度［33］。因此，本研究采取了HPV L1-PCR結(jié)合p16-IHC聯(lián)合檢測，以識別HPV相關(guān)的OSCC標(biāo)本。結(jié)果顯示，僅0.7%的標(biāo)本同時呈現(xiàn)2項(xiàng)檢測陽性，提示HPV在OSCC中的致病作用可能較為有限。該結(jié)果可能受到多種因素的影響，包括HPV L1區(qū)域在病毒整合過程中的丟失［34］、FFPE組織中病毒DNA降解的可能［35］，以及口腔上皮組織中p16表達(dá)的變異性［36］。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究采用多EBV基因片段PCR擴(kuò)增策略以提高檢測靈敏度，但可能帶來假陽性風(fēng)險。通過IHC及ISH證實(shí)，在EBV-PCR陽性O(shè)SCC標(biāo)本中，95.0%（76/80）的腫瘤細(xì)胞至少表達(dá)一種EBV編碼蛋白或EBER，驗(yàn)證了本研究EBV-PCR檢測的可靠性。其次，本研究主要采用HPV-PCR和p16-IHC檢測高危型HPV，因其與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。然而，有研究表明，低危型HPV的E6和E7蛋白與EBV的LMP-1蛋白共同作用，誘發(fā)DNA損傷，并與口腔癌前病變相關(guān)［37］。低危型HPV相關(guān)腫瘤通常不表現(xiàn)出顯著的p16過表達(dá)［38］，因此本研究有可能低估了低危型HPV在EBV共同感染OSCC發(fā)展中的潛在作用。未來研究需進(jìn)一步探討OSCC中低危型HPV與EBV的共同感染情況，以更全面地闡明不同類型HPV在OSCC發(fā)病機(jī)制中的作用。最后，本研究僅收集廣州地區(qū)兩家三甲醫(yī)院的標(biāo)本，仍需擴(kuò)大多中心樣本量以進(jìn)一步提升結(jié)果的代表性與可靠性。

綜上所述，以中山大學(xué)附屬醫(yī)院的標(biāo)本為例，廣州地區(qū)OSCC中EBV檢出率為26.3%，EBER主要定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，且以Ⅲ型潛伏感染為主，提示EBV可能在部分OSCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。相比之下，HPV相關(guān)OSCC少見，表明HPV感染在OSCC發(fā)病機(jī)制中的作用可能較為有限。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

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（責(zé)任編輯：洪悅民）