【摘要】 目的 通過(guò)同軸生物3D打印技術(shù)構(gòu)建間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的3D仿生分布設(shè)計(jì)支架（Shell-Core支架），并對(duì)該種支架的仿生血管化功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。方法 通過(guò)同軸生物3D打印技術(shù)構(gòu)建Shell-Core支架，并通過(guò)光鏡、染色實(shí)驗(yàn)等方式對(duì)其仿生結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分組觀察比對(duì)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其體外促血管化效果。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)仿生支架細(xì)胞的RNA表達(dá)水平。結(jié)果 成功構(gòu)建了Shell-Core支架，其結(jié)構(gòu)具有高度保真性，該結(jié)構(gòu)可以保持到構(gòu)建后的第7日。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示在第7日可以觀察到支架中細(xì)胞增殖速度超過(guò)2D平面下混合培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示Shell-Core條件培養(yǎng)基處理組的HUVECs劃痕縮短距離大于細(xì)胞隨機(jī)散在分布的3D-Mix條件培養(yǎng)基處理組和無(wú)血清DMEM處理組［（431.6±

=-33.6）μm vs.（378.7±22.5）μm vs.（302.3±20.1）μm，均P lt; 0.01］。將仿生分布設(shè)計(jì)的組織工程體外培養(yǎng)7 d后在熒光顯微鏡下可以觀察到表達(dá)綠色熒光蛋白的HUVECs仍維持在設(shè)計(jì)的核通道內(nèi)，并向四周自組裝出內(nèi)皮細(xì)胞芽。qRT-PCR的結(jié)果顯示Shell-Core支架中細(xì)胞的MMP-9基因表達(dá)高于3D-Mix支架［（1.55±0.06）倍，P lt; 0.01］. 結(jié)論 Shell-Core支架在確保了仿生設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)高度保真性的同時(shí)具有促進(jìn)血管化的作用，為解決組織缺損的修復(fù)、制造血管化的工程器官提供了新思路，也可為藥物測(cè)試、研究血管發(fā)生等提供新的組織模型。

【關(guān)鍵詞】 同軸生物3D打??；預(yù)血管化；仿生設(shè)計(jì)；間充質(zhì)干細(xì)胞；血管生成；組織修復(fù)

3D biomimetic design of mesenchymal stem cells and endothelial cells promotes the vascularization

of tissue engineering scaffold

TAN Jiameng 1， WU Yu 1， CHEN Jianwei 2， ZHU Delong1，3， WANG Kun 3 ， ZHU Lei1

（1.Department of Plastic and Aesthetic Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China；2. Bio-Intelligent Manufacturing and Bioprinting Research Center， Shenzhen Tsinghua Research Institute， Shenzhen 518063， China；3.Department of Joint and Trauma Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China）

Corresponding authors： WANG Kun， E-mail： wangk@mail.sysu.edu.cn； ZHU Lei， E-mail： zhulei@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To fabricate 3D biomimetic design of tissue engineering scaffolds （Shell-Core scaffolds） incorporating mesenchymal stem cells （MSCs） and human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） by using advanced coaxial 3D bioprinting technology， and to validate the biomimetic vascularization capacity of the scaffolds by experiments. Methods The Shell-Core scaffolds were successfully fabricated via coaxial 3D bioprinting technology. The biomimetic structural features were characterized using optical microscopy and histological staining assay. The in vitro pro-angiogenic capacity was evaluated through inter-group comparative observations and cell scratch assays. Furthermore， qRT-PCR was employed to quantify RNA expression levels of angiogenesis-related markers in cells cultured on the Shell-Core scaffolds. Results Shell-Core scaffolds were successfully fabricated. The scaffolds possessed high structural fidelity， which could be maintained at 7 d after scaffold fabrication. Cell proliferation assay showed that the cell proliferation rate in the scaffolds at 7 d was higher than that in the mixed culture on the 2D plane. Cell scratch assay showed that the shortening scratch distance of HUVECs treated by Shell-Core-CM was significantly greater than those treated by 3D-Mix-CM and blank groups ［（431.6±33.6） μm vs. （378.7±22.5） μm vs. （302.3±20.1） μm， both P lt; 0.01］. At 7 d after in vitro cultured of engineered biomimetic tissues， under fluorescence microscope， HUVECs expressing green fluorescent protein remained in the designed core channel， and self-assembled endothelial buds in all directions. Furthermore， the results of qRT-PCR show that quantified RNA expression levels of angiogenesis-related markers（MMP-9） in cells cultured on the Shell-Core scaffolds was significantly higher（1.55±0.06，P lt; 0.01） than that in 3D-Mix scaffolds. Conclusions The Shell-Core scaffolds integrating MSCs and HUVECs demonstrates high structural fidelity and pro-angiogenic capacity， offering a novel strategy for addressing tissue defect repair and fabricating vascularized engineered organs. This platform further provides a physiologically relevant tissue model for drug testing and mechanistic investigation of angiogenesis.

【Key words】 Coaxial 3D bioprinting； Pre-vascularization； Biomimetic design； Mesenchymal stem cell； Angiogenesis；

Tissue repair

缺損組織和受損器官的修復(fù)與重建一直是醫(yī)學(xué)界的重要挑戰(zhàn)，修復(fù)與重建效果不佳不僅給患者帶來(lái)了長(zhǎng)期困擾，也成為其家庭和醫(yī)療保健系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。對(duì)此，利用組織工程和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)人工的組織工程展現(xiàn)出了巨大潛力，部分成果已經(jīng)轉(zhuǎn)化為實(shí)際的治療措施［2-3］。其中，組織工程的血管化程度與速度是其存活與發(fā)揮功效的關(guān)鍵影響因素［4］。研究者常將間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和內(nèi)皮細(xì)胞與組織工程結(jié)合并將其用于血管化研究。目前的組織工程構(gòu)建策略以簡(jiǎn)單地將MSCs與內(nèi)皮細(xì)胞混合于生物材料形成混懸液后進(jìn)行打印為主，這會(huì)導(dǎo)致多種細(xì)胞無(wú)序隨機(jī)散在分布。然而，人體內(nèi)各種細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中的分布并不如此，而是更為有序地分布于不同的位置。例如，內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)往往是緊密連接并貼附于中空的管道內(nèi)表面，而MSCs等支持細(xì)胞則散在分布于管壁外甚至更遠(yuǎn)的基質(zhì)中。因此，本研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行組織工程構(gòu)建時(shí)，進(jìn)行了2種細(xì)胞的仿生分布設(shè)計(jì)，通過(guò)結(jié)合同軸噴嘴與傳統(tǒng)3D打印技術(shù)，以簡(jiǎn)單步驟實(shí)現(xiàn)組織工程中細(xì)胞的分區(qū)分布，成功構(gòu)建了MSCs與內(nèi)皮細(xì)胞2種細(xì)胞分區(qū)分布的仿生支架，并探討了其在促進(jìn)血管生成方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

人類脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）購(gòu)自美國(guó)SciencellTM研究實(shí)驗(yàn)

室，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cellsHUVECs）以及表達(dá)綠色熒光蛋白的

HUVECs（GFP-HUVECs）購(gòu)自Lonza（Walkersville，MD）。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司。細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。甲基丙烯?；髂z（gelatin methacryloyl，GelMA）、苯基-2， 4， 6-三甲基苯甲?；?磷酸鋰鹽（lithium phenyl-2， 4，6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP）和藍(lán)色光源（3 W，405 nm）購(gòu)自蘇州智能制造研究院。明膠購(gòu)自Aladdin公司。阿爾瑪藍(lán)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。生物3D打印機(jī)（Livprint norm）購(gòu)自中國(guó)廣州邁普再生醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度約80%時(shí)進(jìn)行傳代，每隔一日更新一次培養(yǎng)基。

1.2.2 染色標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞

使用細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒對(duì)MSCs進(jìn)行細(xì)胞膜染色標(biāo)記。按照制造商的說(shuō)明書制備染色工作液。將MSCs培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸走，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3遍，然后加入5 mL的1， 1’-dioctadecyl-3， 3， 3’， 3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（Dil）染色工作液，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min。吸收染料工作液，用DMEM洗滌3次后，加入完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 構(gòu)建間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞3D仿生分布設(shè)計(jì)支架

構(gòu)建MSCs與HUVECs的3D仿生分布設(shè)計(jì)組織工程（Shell-Core支架）。分別制備含細(xì)胞的殼通道和核通道生物墨水。殼通道生物墨水：采用DMEM制備包含LAP（質(zhì)量與體積比為0.3%）的GelMA溶液（質(zhì)量與體積比為5%），然后用過(guò)濾精度為0.22 μm的過(guò)濾膜（Millipore Corp，Burlington，MA，USA）過(guò)濾GelMA溶液。核通道生物墨水：采用DMEM制備明膠溶液（質(zhì)量與體積比為5%）。分別用殼通道生物墨水和核通道生物墨水重懸MSCs沉淀和HUVECs沉淀。MSCs最終濃度為

1.5×106個(gè)/mL，HUVECs最終濃度為5×106個(gè)/mL。

將上述生物墨水分別泵入同軸噴嘴的殼通道和核通道，通過(guò)生物3D打印機(jī)構(gòu)建Shell-Core支架。打印設(shè)置參數(shù)：支架大小為10 mm×10 mm×2 mm，同軸噴嘴內(nèi)通道直徑約為200 μm，外通道直徑約為550 μm，內(nèi)通道生物墨水的擠出速度為0.5 mL/min，外通道生物墨水的擠出速度為3 mL/min，打印速度為10 mm/s，打印環(huán)境溫度為21 ℃，接收平臺(tái)溫度為10 ℃。支架按上述參數(shù)進(jìn)行打印，打印后立即用波長(zhǎng)為405 nm、強(qiáng)度為100 mW/cm2的藍(lán)光照射40 s，使GelMA完全光交聯(lián)，然后用生理鹽水清洗3次，加入完全培養(yǎng)基，在37 ℃和

5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

構(gòu)建MSCs與HUVECs隨機(jī)散在分布的組織工程（3D-Mix支架）。將MSCs與HUVECs按1∶1比例混合于殼通道的生物墨水中，2種細(xì)胞的最終濃度均為1.5×106個(gè)/mL，用普通噴嘴直接進(jìn)行3D打印。體外培養(yǎng)條件與Shell-Core支架一致。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用阿爾瑪藍(lán)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。Shell-Core支架被均勻地切成4份，并分別放置在24孔板中培養(yǎng)。2D平面混合培養(yǎng)組（Co-culture組）的細(xì)胞培養(yǎng)如下，將MSCs與HUVECs按1∶1比例接種于6孔板，每孔最終接種0.8×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基與Shell-Core支架一致，均置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照制造商的說(shuō)明書配制工作液，檢測(cè)時(shí)，吸出被檢測(cè)孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每孔加入2 mL工作液，同時(shí)在空白孔中加入工作液作為空白對(duì)照孔，于37 ℃下孵育5 h。隨后在每個(gè)孔板孵育的工作液中吸取100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板上，并在570 nm和630 nm處測(cè)量吸光值（optical density，OD），將空白對(duì)照孔的工作液測(cè)得的OD作為基線。每次檢測(cè)完畢后吸去剩余的工作液，每孔用PBS清洗3次，并更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行體外培養(yǎng)。每個(gè)樣品分別在培養(yǎng)至第1、4、7日進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估3D仿生分布設(shè)計(jì)是否影響支架的旁分泌，并通過(guò)旁分泌的方式對(duì)HUVECs遷移產(chǎn)生影響，從而影響血管化。實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)組，分別為空白組（DMEM組）、作為對(duì)照組的3D-Mix組、實(shí)驗(yàn)組Shell-Core組。體外培養(yǎng)的第4日，3D-Mix組與Shell-Core組均倒去培養(yǎng)基，用無(wú)血清DMEM清洗3次，每孔加入2 mL無(wú)血清DMEM，在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別收集上清液作為條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM），1 500轉(zhuǎn)/分離心10 min，于-80 ℃下保存待進(jìn)一步使用。在6孔板中接種HUVECs進(jìn)行培養(yǎng)，待其細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，用PBS清洗2次，加入新鮮無(wú)血清DMEM饑餓處理過(guò)夜，再用1 000 μL移液管尖在單層HUVECs中劃出一條條狀空白區(qū)域（即劃痕）。隨后立即用PBS輕柔清洗2次以去除脫落的細(xì)胞，將Shell-Core-CM以及3D-Mix-CM解凍加熱至37 ℃，分別加入至帶細(xì)胞劃痕的6孔板孔中，空白組的孔中則加入無(wú)血清DMEM。分別在0 h和24 h用顯微鏡觀察拍照，通過(guò)測(cè)量HUVECs沿劃痕區(qū)域?qū)挾瓤s小的距離來(lái)量化遷移/增殖水平。劃痕寬度縮短距離為0 h劃痕寬度與24 h劃痕寬度之差。

1.2.6 支架血管化比較

評(píng)估Shell-Core支架的結(jié)構(gòu)保真性、結(jié)構(gòu)的維持時(shí)長(zhǎng)以及打印后支架在不同時(shí)間的演變，以探究3D仿生分布設(shè)計(jì)對(duì)支架功能化的影響。具體來(lái)說(shuō)，同時(shí)構(gòu)建Shell-Core支架和3D-Mix支架，在打印后當(dāng)日與第7日在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察2種支架血管化情況并拍照。其中在熒光顯微鏡下，Dil-MSCs顯示為紅色，GFP-HUVECs顯示為綠色。

1.2.7 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

為了評(píng)估3D仿生分布設(shè)計(jì)對(duì)支架血管生成基因表達(dá)的影響，將Shell-Core組與3D-Mix組體外培養(yǎng)7 d，分別提取支架總RNA，評(píng)估基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）的表達(dá)。按照制造商的說(shuō)明書提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。采用LightCycler 480 實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為管家基因，每個(gè)樣品測(cè)量3次。相對(duì)基因表達(dá)量采用2-??Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示。2組間均數(shù)采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，P lt; 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建Shell-Core支架

采用同軸噴嘴（圖1A），結(jié)合傳統(tǒng)的堆疊式3D生物打印機(jī)，以實(shí)現(xiàn)2種生物墨水在噴嘴的不同部位被同時(shí)擠出，2種細(xì)胞精準(zhǔn)分區(qū)，沉積殼層、包裹核層，組成殼-核結(jié)構(gòu)條狀纖維（圖1B），這種異質(zhì)結(jié)構(gòu)的條狀纖維在接收平臺(tái)上平行排列逐層累積，從而完成整個(gè)Shell-Core支架的構(gòu)建。支架構(gòu)建后在體外培養(yǎng)第2日，可觀察到核通道內(nèi)的HUVECs黏附于中空通道的內(nèi)壁并由載MSCs的殼層包繞（圖1C）。為了更好地觀察支架內(nèi)細(xì)胞的分布，使用Dil-MSCs（紅色）與GFP-HUVECs（綠色）進(jìn)行打印，在體外培養(yǎng)第7日于熒光顯微鏡下觀察，GFP-HUVECs仍緊密連接成細(xì)胞索道分布于核通道，Dil-MSCs均勻散在分布于殼通道材料中（圖1D），實(shí)現(xiàn)了使MSCs與HUVECs按設(shè)計(jì)精準(zhǔn)分區(qū)沉積。經(jīng)觀察，這種仿生結(jié)構(gòu)可以至少保持到構(gòu)建后的第7日。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

Shell-Core組體外培養(yǎng)第4日的細(xì)胞增殖比Co-culture組慢（1.221±0.135 vs. 1.372±0.080，P lt;"0.05），但隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，支架中細(xì)胞增殖速度明顯增加（圖2），在第7日可以觀察到支架中細(xì)胞增殖速度超過(guò)Co-culture組的增殖速度（1.996±0.056 vs. 1.530±0.060，P lt; 0.01）。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

各組在劃好劃痕后分別用無(wú)血清DMEM、3D-Mix-CM或Shell-Core-CM處理24 h。結(jié)果顯示，在24 h時(shí)，Shell-Core-CM處理的HUVECs劃痕縮短距離明顯大于3D-Mix組和DMEM組［（431.6±33.6）μm vs.（378.7±22.5）μm vs.（302.3±20.1）μm，均P lt; 0.01］，提示MSCs與HUVECs 3D仿生分布設(shè)計(jì)通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)HUVECs遷移，從而有效血管化（圖3）。

2.4 支架血管化與qRT -PCR結(jié)果

打印后當(dāng)日，MSCs和 HUVECs按3D仿生分布設(shè)計(jì)精準(zhǔn)分布于Shell-Core支架中相應(yīng)的位置，而在3D-Mix支架中，2種細(xì)胞則隨機(jī)散在分布。體外培養(yǎng)第7日可以觀察到HUVECs在中空通道內(nèi)表面覆蓋并相互連接，初步形成了血管化通道。在支架中多個(gè)部位也可以觀察到自組裝的內(nèi)皮細(xì)胞芽，且越接近預(yù)制的內(nèi)皮管道自組裝的內(nèi)皮細(xì)胞芽密度越高。而在3D-Mix支架中，HUVECs僅在原位增殖呈細(xì)胞團(tuán)，幾乎見(jiàn)不到Shell-Core支架中HUVECs自組裝現(xiàn)象。

通過(guò)qRT-PCR比較了Shell-Core支架和3D-Mix支架的MMP-9基因的表達(dá)。結(jié)果顯示Shell-Core支架MMP-9的mRNA表達(dá)量是3D-Mix組的（1.55±0.06）倍（P lt; 0.01），提示3D仿生分區(qū)設(shè)計(jì)可能通過(guò)上調(diào)MMP-9的表達(dá)促進(jìn)HUVECs的遷移和血管生成（圖4）。

3 討 論

近年來(lái)，3D生物打印技術(shù)作為新興技術(shù)成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5-6］。3D生物打印是通過(guò)層層沉積的方式，將生物相容性的材料和活細(xì)胞組分構(gòu)建出生物組織結(jié)構(gòu)，旨在模擬體內(nèi)基質(zhì)成分和微環(huán)境的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能，已經(jīng)在模擬肝組織、腫瘤、皮膚等領(lǐng)域得到應(yīng)用［7-10］。

傳統(tǒng)的組織工程常將MSCs、多能干細(xì)胞等引入合適的支架并植入體內(nèi)以治療組織缺損［11］。然而，當(dāng)植入物細(xì)胞致密或者體積較大的時(shí)候，常難以實(shí)現(xiàn)移植物中心區(qū)域快速血管化，致使氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及代謝廢物高度依賴簡(jiǎn)單擴(kuò)散進(jìn)出組織，會(huì)出現(xiàn)移植物中心壞死導(dǎo)致移植失敗，從而影響組織修復(fù)的效率［12］?？焖俸统浞值难苄纬蓪?duì)于移植后的組織工程移植物中細(xì)胞存活與發(fā)揮功能作用顯得至關(guān)重要。為了克服這些問(wèn)題，有必要制定血管化策略，旨在使組織工程移植物移植入體內(nèi)后能快速有效地血管化［13］。目前組織工程的血管化策略主要是在組織工程中添加各種生長(zhǎng)因子、小分子藥物等促進(jìn)血管生成，側(cè)重于刺激血管從周圍組織長(zhǎng)入移植物，但這個(gè)過(guò)程通常非常緩慢［7］。研究表明，新生血管的生成速度約為5 μm/h［14］，這也意味著即便是厚度僅2 mm的移植物仍需幾個(gè)星期才能完全血管化，這依賴于添加物的穩(wěn)定長(zhǎng)期釋放。因此，組織工程不應(yīng)該僅依賴于簡(jiǎn)單的成分添加。

部分研究表明，細(xì)胞圖案化空間分布的仿生設(shè)計(jì)可使組織工程在體外實(shí)現(xiàn)預(yù)血管化，并在組織工程移植進(jìn)體內(nèi)后快速血管化，從而更好地實(shí)現(xiàn)修復(fù)效果。MSCs和內(nèi)皮細(xì)胞常常結(jié)合組織工程被用于血管化研究，傳統(tǒng)的組織工程構(gòu)建策略［15-16］僅簡(jiǎn)單將這些細(xì)胞混合于生物材料形成混懸液后進(jìn)行打印，以構(gòu)建多種細(xì)胞無(wú)序隨機(jī)散在分布的組織工程［17-18］。而圖案化的異質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)能使不同細(xì)胞更有序地分布于不同的位置，以達(dá)到2種甚至多種細(xì)胞的仿生分布設(shè)計(jì)［19］。如內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)往往是緊密貼附中空的管道內(nèi)表面，而MSCs等支持細(xì)胞則散在分布于管壁外甚至更遠(yuǎn)的基質(zhì)中。部分研究顯示，通過(guò)在移植物移植前構(gòu)建微血管網(wǎng)絡(luò)，能有效促使移植物在植入體內(nèi)后快速血管化，甚至直接與宿主的微血管融合從而實(shí)現(xiàn)更早期的血液灌注［20］。因此，本研究在進(jìn)行組織工程支架構(gòu)建時(shí)，將3D打印與同軸噴嘴結(jié)合，將MSCs置于殼通道材料，巧妙利用殼通道中GelMA的特性，并置內(nèi)皮細(xì)胞于核通道的犧牲材料中。2種通道同時(shí)于同軸噴嘴擠出，在單一步驟中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分區(qū)分布，成功實(shí)現(xiàn)2種細(xì)胞的圖案化仿生分布?？梢杂^察到，在本研究構(gòu)建的Shell-Core支架中，GFP-HUVECs之間相互連接并黏附于中空管道內(nèi)壁，以模擬真皮組織中密集的血管結(jié)構(gòu)，MSCs則分布于管壁外基質(zhì)中，以模擬真皮組織中的干細(xì)胞分布。在長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)的觀察中，2種細(xì)胞精準(zhǔn)分區(qū)沉積的3D仿生分布設(shè)計(jì)能夠在體外保持穩(wěn)定，使2種細(xì)胞在支架內(nèi)實(shí)現(xiàn)仿生的空間分布，明確了該支架有較好的結(jié)構(gòu)保真性，同時(shí)為后續(xù)構(gòu)建多種細(xì)胞且更復(fù)雜的仿生組織工程奠定基礎(chǔ)。經(jīng)觀察，本研究的Shell-Core支架在體外能長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，且能夠維持高的增殖活性。

本研究對(duì)Shell-Core支架功能化進(jìn)行了初步探討，Shell-Core支架在體外通過(guò)促進(jìn)HUVECs遷移、促進(jìn)其自組裝等而表現(xiàn)出一定的功能化。在顯微鏡下可以觀察到，HUVECs不僅緊密覆蓋于核通道內(nèi)表面，而且向四周的殼通道材料遷移萌芽、自我組裝，從而形成各種尺寸的內(nèi)皮細(xì)胞芽。研究表明，與單個(gè)細(xì)胞的接種方式相比，在水凝膠中以細(xì)胞團(tuán)接種的形式能更快促進(jìn)體外預(yù)血管化，這可能與圖案化設(shè)計(jì)能提高局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞的濃度有關(guān)［21］，且MSCs具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自組裝的作用［22］，與本研究的結(jié)論一致。這種3D仿生分布的設(shè)計(jì)允許內(nèi)皮細(xì)胞在中空管道內(nèi)表面伸展并直接接觸，局部提高了內(nèi)皮細(xì)胞濃度，能早期實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的直接接觸交流。目前的研究已經(jīng)證實(shí)了MSCs可以通過(guò)促進(jìn)血管化而實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)［23］。本研究構(gòu)建的Shell-Core支架不僅能在體外直接預(yù)制血管通道，且誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞快速自組裝并向管壁外生芽，迅速實(shí)現(xiàn)組織工程的體外多級(jí)血管化，且能通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移從而促進(jìn)血管化。大量研究表明，各種MMP在血管生成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，尤其是在促進(jìn)血管萌發(fā)方面［24-26］，本研究顯示Shell-Core支架的MMP-9表達(dá)增高。因此，該支架除了能實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞與支持細(xì)胞仿生分布設(shè)計(jì)之外，還實(shí)現(xiàn)了支架的功能化。

綜上，本研究提出了一種將MSCs與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行3D仿生分布設(shè)計(jì)的打印策略，通過(guò)同軸噴嘴與傳統(tǒng)3D技術(shù)成功打印出2種細(xì)胞仿生分布的組織工程支架，且實(shí)現(xiàn)了這種仿生設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)的高度保真性，為組織工程血管化提供了簡(jiǎn)單策略。除此之外，本研究進(jìn)一步明確了這種3D仿生設(shè)計(jì)在體外的促進(jìn)血管化作用，提示這種仿生設(shè)計(jì)或具有較大的應(yīng)用前景。本研究仍存在一定局限性，未能明確該支架預(yù)制的內(nèi)皮通道及其體外自組裝形成的血管網(wǎng)絡(luò)是否直接與宿主血管網(wǎng)絡(luò)吻合從而實(shí)現(xiàn)早期灌注，這也是未來(lái)研究的側(cè)重點(diǎn)。未來(lái)，可以考慮引入多種細(xì)胞、設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的仿生分布，為解決組織缺損的修復(fù)提出新方案，甚至為制造血管化的器官工程提出新方案，也可為藥物測(cè)試、研究血管發(fā)生等提供新的組織模型。

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（責(zé)任編輯：洪悅民）