摘要為建立小黑杪（Gymnosphaera meteniana）組織培養(yǎng)繁殖體系，優(yōu)化其繁殖過程，通過小黑杪羅孢子萌發(fā)后的原葉體作為外植體，研究不同生長素和細胞分裂素對配子體增殖、分化及孢子體生根的影響。結果表明;配子體增殖，在 蔗糖 瓊脂 中增殖效果最好，增殖倍數(shù)為14.84 倍，增殖后鮮重為 ，直徑為 ；配子體分化，在 蔗糖 瓊脂 中分化率最高，分化率為 8 5 . 9 3 % ;孢子體生根，在 蔗糖 瓊脂 中生根率最高，生根率達 7 7 . 7 8 % ，平均生根數(shù)為1.42根。

關鍵詞原葉體；配子體；孢子體；小黑杪中圖分類號Q813.1 文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）08-0100-05doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.021

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AbstractTopeliiiltablishisueulurepropagtionsstemforGymoserameeianandoiizeitseprdutioproe prothallderdfrospegeaoeedaseantstdtsoffeusdsoholfaddferentiatinofmetssellasigofspropts.eulsevealedatfoametopteproliferatiotstsultwas tained in 1/2 MS medium with kinetin（KT）， sucrose，and agar，with a proliferation multiplier of 14.84 times.The fresh weight after proliferation was ，and the diameter was The highest diferentiation rate of the gametophyte was achieved in 1/2 MS medium with KT， sucrose，and agar，with adifferentiationrate of 8 5 . 9 3 % .The best rooting of sporophytes occurred in 1/2 MS medium with indole-3-butyric acid（IBA）， sucrose，and agar，with the highest rooting rate of 7 7 . 7 8 % and an average of 1.42 roots per sporophyte.

Key words Prothallus；Gametophyte；Sporophyte；Gymnosphaera metteniana

小黑杪（Gymnosphaerametteniana）屬杪科（Cya-theaceae）黑杪屬（Gymnosphaera），國內(nèi)主要分布在貴州、云南、四川、重慶、廣東等地[1]。相對于杪（Alsophila spinulosa）而言，小黑杪植株矮小且孢子囊群位于小脈中部[2]小黑杪羅富含多糖、有機酸、黃酮等活性物質(zhì)，并具有一定觀賞價值[3-6]。杪科各物種自然雜交現(xiàn)象十分普遍，雜交種已占總數(shù)的 5 0 % 以上，其中，小黑杪是粗齒杪（Alsophiladenticulata）和大葉黑杪（Alsophilagigantea）的雜交種[7]。小黑杪稷存在一個變種光葉小黑杪，與小黑杪稷具有相同的生境，二者的區(qū)別在于光葉小黑秘稷小羽片背面和腹面均光滑，且無針狀長毛[8]。野外自然環(huán)境中，小黑杪和其他蕨類植物一樣，借助水的作用，通過孢子實現(xiàn)繁殖。但伴隨著亂砍濫伐和建造房屋等人為因素，小黑杪在野外適宜的生存環(huán)境不斷縮小。其生長條件苛刻，自然條件下小黑秒孢子繁殖周期長，生長緩慢且存活率不高。有研究發(fā)現(xiàn)，小黑杪孢子的萌發(fā)受多種環(huán)境因素影響，包括光質(zhì) 、光照強度和溫度等。其中，光照強度維持在 時，對孢子的萌發(fā)效果最佳。此外，藍光環(huán)境下孢子的萌發(fā)率最低，藍光對孢子的萌發(fā)還存在顯著的抑制作用[9]。小黑杪孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育也受到無機鹽濃度影響，低濃度下孢子萌發(fā)時間短且萌發(fā)率高，而較高的無機鹽濃度可促進配子體的發(fā)育[10]。近年來，在赤水杪國家級保護區(qū)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小黑杪葉片易被綠帶妒尺蛾（Phthonolbaviridifasciata）和杪葉蜂（Rhoptroceroscyatheae）幼蟲取食，影響小黑杪正常生長發(fā)育與繁殖[]。通過探究植物生長調(diào)節(jié)劑對配子體增殖、分化、孢子體生根等過程的影響，可實現(xiàn)蕨類植物的高效繁殖體系。如王宏航等[1]以12種觀賞蕨類作為材料，發(fā)現(xiàn)在針對蕨類植物配子體增殖方面，MS培養(yǎng)基添加 和 NAA具有顯著的促進作用；而對于蕨類植物孢子體的生根， 1 / 2 MS培養(yǎng)基搭配 IBA效果最佳。王曉倩[13]在對闊鱗鱗毛蕨（Dryopterischampio-nii）的研究中，將孢子通過 赤霉素處理后，蕨類植物在含有 蔗糖和 瓊脂的培養(yǎng)基中，孢子的萌發(fā)率超過 6 0 % 。此外，原葉體在相同培養(yǎng)基條件下具有最大的增殖系數(shù)。而在含有 蔗糖和 瓊脂的培養(yǎng)基中，原葉體的誘導效果最佳，且孢子體在不同生根培養(yǎng)基中均能生根。

蕨類植物組織具有多樣化培養(yǎng)途徑，可以劃分為2種，即孢子作為外植體和孢子體作為外植體2個途徑。孢子作為外植體主要通過不同激素促進孢子萌發(fā)和原葉體生長，進而形成孢子體，最終形成完整植株。孢子體途徑又可以分為3種：一是孢子體形成愈傷組織，再分化形成植株；二是外植體直接形成芽；三是綠色小體（greenglobularbody，GGB）途徑，通過形成原葉體球狀體，經(jīng)過誘導、分化等步驟形成孢子體[14]。孢子可作為外植體，但有的蕨類孢子存在休眠現(xiàn)象，需要打破休眠孢子才能正常萌發(fā)。有研究表明，杪楞孢子成熟后一定概率陷入休眠現(xiàn)象，通過赤霉素處理后可打破休眠，且生長素和細胞分裂素也有利于孢子萌發(fā)[15]。不同蕨類植物可采取不同的組織培養(yǎng)途徑，如張冬瑞等[6]對香鱗毛蕨（Dryopterisfragrans）的研究，通過孢子體形成愈傷組織途徑，發(fā)現(xiàn) 為最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基。葉秀仙[17]以鹿角蕨（Platyceriumwal-lichii）孢子作為外植體，誘導形成GGB，探究6-BA、KT、NAA和IBA對GGB增殖等關鍵環(huán)節(jié)的影響，并建立了鹿角蕨快繁體系。李慧[18]通過革葉蕨（Rumohraadiantiformis）莖段直接誘導形成不定芽，建立革葉蕨的離體培養(yǎng)和快速繁殖體系。筆者探究不同種類激素及濃度對小黑杪組織培養(yǎng)過程的影響，包括不同濃度的IBA、IAA、KT等激素對小黑杪楞配子體增殖、分化、孢子體生根過程的影響。通過對鮮重、分化率和生根率等指標的分析，構建最適條件的繁殖體系，進而為小黑杪繁殖、育種提供技術支撐，為建立小黑杪的繁殖體系并對其種質(zhì)保存、物種開發(fā)提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1原葉體獲得小黑秒楞孢子于2021年9月采自位于貴州赤水杪國家級自然保護區(qū)，將成熟孢子葉放于干凈塑料袋中，干燥環(huán)境下放置一段時間后輕輕振蕩，孢子脫落，收集于 冰箱中備用。試驗前取一定量小黑杪孢子，放于離心管中浸泡 ，離心后去除上清液。之后用 7 5 % 乙醇充分振蕩，無菌水洗4次；加入 5 % NaCIO溶液充分振蕩，無菌水沖洗6次，制成無菌孢子懸浮液。將無菌孢子接種至 蔗糖 瓊脂 培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度 ，光照強度 ，光照時間 （下同） 后獲得小黑杪原葉體。

1.2配子體增殖將小黑杪楞原葉體切割成鮮重約為 的 方塊，接種到1/2MS培養(yǎng)基中，分別添加 ） ），TDZ（ ），IAA（ ，IBA（0.3、0.5、 ），NAA ，蔗糖 ，瓊脂 。每瓶接種3個原葉體，18組各接種15瓶，重復3次，培養(yǎng) 后，統(tǒng)計原葉體的鮮重、增殖倍數(shù)和直徑。

1.3配子體分化把增殖成功且生長狀態(tài)良好的原葉體切割成直徑約 的小球，接種于 培養(yǎng)基，分別加入 ） ，IAA（0.3、 ）， ，蔗糖 ，瓊脂 。將噴壺消毒后每隔10d在配子體表面噴施適量無菌水。每瓶接種一定數(shù)量的原葉體，每組接種3瓶，重復3次。培養(yǎng) 后統(tǒng)計配子體分化率。

1.4孢子體生根將分化成功且生長狀態(tài)良好的孢子體接種在1/2MS培養(yǎng)基中，分別加入IAA（ 和 ，添加蔗糖 瓊脂 5.8。每瓶接種12個，每組接種3瓶，重復3次，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計生根率和生根數(shù)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析所有初始數(shù)據(jù)均使用Excel統(tǒng)計，采用SPSS26.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。分化率和生根率等數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標準誤差表示，利用單因素ANOVA檢驗進行方差分析，顯著性水平 。

增殖倍數(shù) 增殖后原葉體鮮重/0.102式中，0.102為原葉體初始鮮重。

配子體分化率 配子體分化個數(shù)/接種總數(shù) × 1 0 0 % 孢子體生根率 孢子體生根個數(shù)/接種的孢子體總數(shù) × 100 %

平均生根數(shù) 孢子體生根總數(shù)/孢子體總數(shù)

2 結果與分析

2.1不同激素對小黑杪楞配子體增殖的影響 將小黑杪原葉體接種到 處理中（表1），原葉體鮮重、增殖倍數(shù)、直徑有顯著差異（ （表2）。隨著KT濃度上升，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑呈下降趨勢，說明較低濃度的KT對小黑杪羅原葉體增殖起促進作用。隨著6-BA濃度上升，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑呈上升趨勢，說明較高濃度的 BA對小黑杪原葉體增殖起促進作用。當TDZ濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑分別為 、13.33倍2 . 0 9c m ，當TDZ濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑均下降，分別為 倍、 ；當 TDZ濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑均上升，分別為 倍 ，反而均增大?？傮w來說，當培養(yǎng)基中加人低濃度TDZ時，小黑秒原葉體長勢優(yōu)于高濃度TDZ，說明較低濃度TDZ對小黑秒原葉體增殖更有利。KT、6-BA和TDZ均為細胞分裂素類物質(zhì)，但同等濃度下加入KT的培養(yǎng)基，小黑秒配子體鮮重、直徑和增殖倍數(shù)均高于6-BA和TDZ組，說明KT更有利小黑秒楞原葉體增殖，

當IBA濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直 徑分別為 倍" 2 . 2 5 c m ；當IBA濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑均下降，分別為 倍 ；當IBA濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍 數(shù)和直徑均上升，分別為 倍 2 . 2 9" c m" 。當IBA濃 度為 和 時，小黑杪原葉體長勢相差不 大。當IAA濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直 徑分別為 倍、 ；當IAA濃度為 時，原葉體鮮重、增殖倍數(shù)和直徑整體上升，分別為 9.94倍 ；當IAA濃度為 時，原葉體鮮重、增 殖倍數(shù)和直徑均下降，分別為 倍、 ?？梢?， 當IAA濃度為 時，更有利于原葉體增殖。隨著 NAA濃度從 上升到 ，小黑杪原葉體鮮 重、增殖倍數(shù)和直徑呈下降趨勢，說明低濃度NAA更有利于 原葉體增殖。綜合來看，培養(yǎng)基為 T時， 最有利于原葉體增殖（表2）。

2.2不同激素對小黑杪配子體分化的影響將生長狀態(tài)良好的原葉體接種至 分化培養(yǎng)基上，分化率存在顯著差異（ ）。隨著KT濃度的升高，配子體分化率表現(xiàn)出先降后升的趨勢。當KT濃度小于 時，配子體分化率隨KT濃度升高而降低；而當KT濃度大于 時，配子體分化率則隨著KT濃度的升高而升高，即當KT濃度為 ，分化率最高，達 8 5 . 9 3 % 。但隨著TDZ 濃度上升時，配子體分化率逐漸下降，且當TDZ濃度為0.3、0.5和0.7mg/L時，分化率均低于KT3個濃度下的最小值 5 4 . 0 6 % 。隨著IBA濃度升高，配子體分化率先降后升，當IBA濃度為 ，分化率最低，為 6 0 . 0 0 % ；當IBA濃度為 時，分化率最高，達 6 3 . 8 9 % 。當IAA濃度為 時，配子體分化率為 5 6 . 8 5 % ；當IAA濃度為 時，配子體分化率升高至 6 0 . 0 4 % ；然而當IAA濃度為 時，配子體分化率降低到 5 0 . 0 3 % 。綜上所述，配子體在 處理培養(yǎng)基中，即選取 作為配子體分化的最佳培養(yǎng)基，并且 處理與其他處理（除 處理）間存在顯著差異0 （表3）。0.3和 KT配子體增殖和分化情況如圖1、2所示。

2.3不同激素對小黑杪楞孢子體生根的影響將長勢良好的孢子體接種于 生根培養(yǎng)基中，隨著IBA濃度升高，生根率先上升后下降，且各處理生根率間不具有顯著差異（ 。IBA濃度為 時，孢子體生根率達到最高水平，為 7 7 . 7 8 % ；隨著IAA濃度上升，生根率逐漸降低，當IAA濃度為 時，生根率達到最大值，為 6 6 . 6 7 % ，顯示出較低濃度的IAA更有利于孢子體的生根（表4）。隨著IAA濃度升高，平均生根數(shù)先上升后下降， 濃度時達到最高值（0.89）。隨著IBA濃度升高，平均生根數(shù)也呈先上升后下降趨勢。在相同濃度下，IBA處理的平均生根數(shù)始終高于IAA處理（表4）。綜上所述，小黑杪楞孢子體生根的最適培養(yǎng)基為 。 IBA下孢子體生根情況見圖3。

3討論

該研究探究不同濃度的細胞分裂素和生長素對小黑秒稷組織培養(yǎng)的影響，以小黑秒稷原葉體作為外植體，優(yōu)化配子體增殖、配子體分化、孢子體生根3個階段，以提高原葉體增殖倍數(shù)、配子體分化率和孢子體生根率，建立小黑杪楞快速繁殖體系。研究揭示，在蕨類植物的繁殖和生長階段，包括原葉體的增殖、配子體形態(tài)的演變以及孢子體扎根等過程會受到多種外部環(huán)境因素的影響。這些因素涵蓋了溫度、濕度水平、照明強度與日照時長、所選用的培養(yǎng)基類型、無機鹽的濃度比例、各類糖分及其濃度、植物生長素的品類與濃度以及環(huán)境的 等[19-20]。蕨類植物的組織培養(yǎng)中，植物生長激素發(fā)揮著關鍵作用，對生長和發(fā)育起著重要作用。細胞分裂素6-BA和KT是其中重要的植物生長激素。KT能夠促進芽的分化，而6-BA則有利于綠色小體GGB的形成。有關二歧鹿角蕨（Platyceriumbifurcatum）的研究表明，在

圖1 KT下配子體增殖情況

或者 培養(yǎng)基中，綠色小體GGB的誘導率達到 9 0 % 。未添加6-BA的培養(yǎng)基中，綠色小體GGB的產(chǎn)量減少且體積較小[21]。在莢果蕨（Mat-teucciastruthiopteris）的組織培養(yǎng)中，莢果蕨根狀莖作為外植體，KT濃度為 時，能夠?qū)崿F(xiàn)莢果蕨芽的最佳增殖效果[22]。不同激素對蕨類組織培養(yǎng)有著不同的作用，往往不同的激素配比在不同階段也會發(fā)揮不同的功效。王輝等[19]研究表明，最適合杪配子體增殖的培養(yǎng)基為 NAA 蔗糖 配子體增殖率為 2 0 . 3 1 % ；最適合配子體分化的培養(yǎng)基為 NAA 蔗糖 。對過山蕨的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然對過山蕨GGB的誘導和增殖均使用BA、NAA和活性炭（activatedcarbon，AC），但由于濃度不同， 是誘導形成GGB的最佳培養(yǎng)基，而1/2MS NAA 0.1g/L+AC 0.3g/L是最佳的GGB 增殖培養(yǎng)基[23] 。

生長素和細胞分裂素均能刺激細胞，促進細胞進行有絲分裂。韓汶雨等[24]在對東北對開蕨（Phyllitis japonica）組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)KT和6-BA對原葉體增殖具有促進作用，且伴隨著KT濃度上升，增殖倍數(shù)逐漸下降；隨著6-BA濃度上升，增殖倍數(shù)逐漸下降，且相同濃度下，加入KT的培養(yǎng)基比加入6-BA的培養(yǎng)基增殖倍數(shù)高，都說明低濃度的KT更有利于蕨類植物原葉體增殖，這與該試驗研究結果一致。張薇等[25]研究報道了細胞分裂素 和生長素NAA對瘤蕨（Microsorumscolopendria）原葉體增殖有促進作用，且發(fā)現(xiàn)最適合瘤蕨原葉體增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑為 KT，與該試驗不同之處在于隨著KT濃度上升，原葉體增殖倍數(shù)先上升后下降，這可能是由于不同蕨類植物對不同濃度、不同激素的適應性存在一定差別。試驗中發(fā)現(xiàn)，6-BA和

TDZ雖然能誘導配子體增殖，但是誘導時間長，原葉體有絨毛，且顏色呈現(xiàn)黃綠色。然而，當激素為 ，不僅誘導時間短，長勢良好，且原葉體顏色呈碧綠色，這與顧德峰等[26]對東亞對開蕨原葉體發(fā)育的研究結論相似，在KT濃度為 時，最有利于促進原葉體增殖。

小黑杪稷配子體分化最關鍵的步驟是精子器和頸卵器的形成，只有這2個結構的成熟才能產(chǎn)生精子和卵細胞，最后通過受精作用形成孢子體，進而完成世代交替，開啟新一輪的生命周期。相關研究已證實，無機鹽離子、赤霉素和光質(zhì)等因素對配子體分化有影響，這些因素在蕨類植物的生長和發(fā)育中起重要作用，在組織培養(yǎng)中能夠調(diào)節(jié)配子體的發(fā)育。戴雙[27]研究表明，鈣離子和赤霉素會影響荷葉鐵線蕨（Adiantumreniforme）頸卵器的形成，當鈣離子濃度為0.2mg/L時，最有利于頸卵器的形成，且對分生區(qū)的形成具有促進作用；赤霉素對國家二級保護植物金毛狗蕨（Cibotiumbarometz）精子器的形成具有明顯的促進作用，但對頸卵器的形成具有明顯的抑制作用[28]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，KT是影響小黑杪稷配子體分化的因素之一，當KT濃度為 時，配子體分化率明顯高于IAA、IBA組，這與朗月婷等[29對陰生杪（ A l -sophilalatebrosa）的研究存在一定區(qū)別。當KT濃度低于 時，二者配子體分化率均隨著KT濃度的上升逐漸下降，但當KT濃度大于 時，小黑秒配子體分化率隨著KT濃度上升而增加，而陰生杪相反，說明杪稷屬配子體分化對激素具有一定的種間差異性。TDZ和KT、IBA、IAA對比之下，各濃度分化率均偏低，試驗中還發(fā)現(xiàn)TDZ誘導分化時，會出現(xiàn)配子體莖葉分化少、葉片發(fā)黃、孢子體矮小等現(xiàn)象，但KT組各濃度下的長勢均處于良好狀態(tài)。

蕨類孢子體分化階段，誘導生根是重要操作之一，IBA和IAA都是常見的生根誘導激素。付偉等[30]研究發(fā)現(xiàn)，IBA對河北峨眉蕨（Lunathyriumvegetius）孢子體生根起促進作用，孫曉丹[31]報道了生長素IBA對桂皮紫萁（Osmundacin-namomeavar.asiatica）孢子體的生根具有促進作用，同時孢子體根數(shù)多，長勢好。這與該試驗一致，當IBA濃度為 ，孢子體生根率最高。陳習等[32]研究發(fā)現(xiàn)，IAA對狹葉金星蕨（Parathelypterisangusti-frons）孢子體生根起促進作用，生根率為 100 % ，且當IAA濃度低于 時，根數(shù)、冠幅、株高和根直徑均隨著濃度的升高而上升。筆者研究表明，IAA和IBA對小黑杪孢子體生根并不具備顯著差異，說明2種生長素均可作為小黑秒孢子體生根的誘導激素，但陳習等[32]卻發(fā)現(xiàn)IAA和IBA對狹葉金星蕨孢子體的生根具有顯著差異。這可能是由于小黑杪對于不同種類的生長素敏感度不如狹葉金星蕨。

4結論

該研究建立了小黑杪的組織培養(yǎng)繁殖體系：小黑杪原葉體在 培養(yǎng)基中生長效果最佳；1/2 是促進小黑秘稷配子體分化的最適培養(yǎng)基；小黑杪孢子體在 培養(yǎng)基中誘導孢子體生根效果最佳。

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